迷迭香酸通過FOXO3a/VEGF信號通路對高糖環境下人視網膜微血管內皮細胞的保護作用及機制研究

王化湘 劉光化 簡唯求 彭輝燦 李姣

近年來，隨著人們生活水平的提高，糖尿病在全球范圍內的發病率逐年上升[1]。作為一種嚴重危害人類健康的慢性代謝性疾病，糖尿病在發展過程中可能伴隨著腎功能衰竭、心血管疾病、視力損害等一系列并發癥[2，3]，給糖尿病患者帶來極大的負擔。其中糖尿病視網膜病變是糖尿病患者出現視力損害最嚴重的并發癥[4]，其病理改變是由于人視網膜微血管內皮細胞（Human retinal micro- vascular endothelial cells，HRMEC）過度增殖導致的新血管生成，嚴重者甚至會導致視力完全喪失[5]。有研究發現，其可能與視網膜組織血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）異常表達有關，過度的VEGF表達能夠刺激血管內皮細胞，提高其增殖與遷移能力，從而形成新的血管[6]。叉頭框轉錄因子O3a（Forkhead box O3a，FOXO3a）是近些年來發現的一種新的轉錄因子，在動物中參與生長發育、細胞分化、代謝凋亡、信號轉導、轉錄和免疫等多種生物學進程，近期在血管生成過程中同樣發現FOXO3a發揮了一定的作用[6]。迷迭香酸是一種多酚酸，在現代藥理學研究中發現其具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種功能[7]。目前有研究表明迷迭香酸能夠抑制VEGF的表達，對腫瘤細胞的增殖有抑制作用[8]，但對于糖尿病視網膜病變影響的相關研究較少。因此本實驗以HRMEC為研究對象，以高糖培養基模擬糖尿病高糖環境[9]，通過分子生物學技術分析迷迭香酸對高糖環境下HRMEC的影響及與FOXO3a/VEGF信號通路相關的可能機制，以期為糖尿病視網膜病變的臨床治療提供新的思路與理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 人視網膜微血管內皮原代細胞購自上海中科院細胞庫；迷迭香酸購自上海恒斐生物科技有限公司；VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；β-actin抗體購自美國貝博生物科技有限公司；PCR引物合成自上海生工生物工程股份有限公司；Trizol Reagent總RNA提取試劑盒購自美國英杰公司；MTT分析試劑盒購自艾博抗（上海）貿易有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；DMSO購自北京索萊寶生物科技有限公司；DMEM培養基購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Western Blot相關試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清購自美國Sigma公司；蛋白電泳儀與轉膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養 將HRMEC置于加入了青霉素（100U/ml）、鏈霉素（0.1mg/ml）及10%胎牛血清的DMEM培養基的培養皿中，設置培養箱培養條件：37℃，含5%CO2；傳代條件：細胞密度>80%，以1：3的比例進行傳代培養。當細胞處于對數生長期時進行試驗。

1.3 實驗分組及處理 將處于對數生長期的HRMEC分為6組。空白組：在原培養基中進行培養；低糖組：在加入低糖培養液（0.5mmol/L）的培養基中進行培養；高糖組：在加入高糖培養液（25mmol/L）的培養基中進行培養；低劑量迷迭香酸組：在高糖培養液中加入12.5μmol/L迷迭香酸進行培養；中劑量迷迭香酸組：在高糖培養液中加入25μmol/L迷迭香酸進行培養；高劑量迷迭香酸組：在高糖培養液中加入50μmol/L迷迭香酸進行培養。

1.4 MTT檢測HRMEC增殖活性 取處于對數生長期的各組HRMEC，使其解離后以5×103細胞/孔的密度在96孔細胞培養板上進行培養，每組細胞設置5個復孔，在培養板邊緣孔中加入無酶水防止液體蒸發。將細胞繼續培養24、48、72h后取出，隨后向每孔中避光加入20μl的MTT粉劑溶液，繼續培養4h后取出用PBS溶液洗滌，加入DMSO溶液20μl，使用酶標儀在490nm波長下測量光密度（OD值），OD值越大代表細胞數量越多，細胞增殖活性越強。

1.5 流式細胞術檢測HRMEC周期 將經處理后的HRMEC懸液離心后棄去上清液，加入預冷70%乙醇固定細胞2h，之后棄去上清液。使用細胞周期檢測試劑盒在避光環境下溶解，并恒溫孵育30min后使用流式細胞儀進行周期檢測，使用流式軟件CytExpert對細胞周期分布結果進行處理。

1.6 Real-time PCR 將收集到的處理后的HRMEC懸液離心后棄去上清液，向沉淀中加入適量Trizol試劑，在冰上孵育5～10min后加入預冷過的氯仿0.2ml。繼續冰上孵育5min后1 200r/min離心15min，轉移水相，加入等體積異丙醇后再次離心10min，棄上清液。加入預冷75%乙醇溶液洗滌，棄上清液后風干，加入40～200μl的無酶水溶解制成RNA備用。通過制備的RNA反轉錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與VEGF的上下游引物混合離心（VEGF基因上游引物為5'-TCGAGACCCTGGTGGACATC-3'，下游引物為5'-CACACAGGACGGCTTGAAGA-3'；β-actin基 因上游引物為5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'，下游引物為5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3'）。隨后于PCR儀上進行擴增，循環完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值（Ct值）進行相對定量分析。

1.7 蛋白免疫印跡試驗（Western Blot） 將收集到的處理后的HRMEC懸液離心后棄去上清液，然后加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑提取總蛋白，提取出的總蛋白放入10ml EP管中，加入十二烷基磺酸鈉混勻后放入95℃～100℃沸水中水煮變性后備用。將提取的總蛋白進行電泳、封閉及轉膜操作。轉膜后分別孵育VEGF（1：1000）、FOXO3a（1：1000）、PCNA（1：1000）、CDK2（1：1000）、Cyclin A1（1：1000）及β-actin（1：500）抗體與相對應的辣根過氧化物酶標記的二抗，最后將含有蛋白標記的膜洗凈，涂上化學發光顯影液后通過顯影儀拍照，對結果用ImageJ軟件對各組HRMEC中不同因子的相對灰度值進行系統性分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，結果以均數±標準差（±s）表示，數據符合正態分布，兩組間均數差異比較采用t檢驗，多組間均值差異比較采用F檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT檢測在高糖環境下不同濃度迷迭香酸對HRMEC增殖活性的影響 經過MTT檢測OD值發現，低糖組中各時間段HRMEC數量均少于高糖組，高糖環境下培養的HRMEC經不同濃度的迷迭香酸處理后，其細胞數量均有所降低，且隨著迷迭香酸濃度的增加以及干預時間的延長，HRMEC數量顯著下降，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同時間點HRMEC數量的比較

2.2 流式細胞術檢測在高糖環境下不同濃度迷迭香酸對HRMEC周期分布的影響 用CytExpert軟件分析結果可發現與空白組及低糖組相比，高糖環境下HRMEC分布于S期的細胞數量顯著增加，G0/G1期數量顯著降低；與高糖組相比，HRMEC經不同濃度的迷迭香酸處理后分布于S期細胞數量減少，G0/G1期的細胞數量明顯增加，差異具有統計學意義（P<0.05）；且隨著迷迭香酸濃度的增加，阻滯于G0/G1期的細胞數量明顯增加。見圖1。

圖1 各組HRMEC周期分布

2.3 Real-time PCR檢測高糖環境下不同濃度迷迭香酸對HRMEC中VEGF mRNA水平的影響 RT-PCR結果顯示，與空白組及低糖組相比，高糖環境下HRMEC中VEGF mRNA水平明顯上升，當經過不同濃度的迷迭香酸處理后，其VEGF mRNA水平明顯下降，且迷迭香酸各劑量組上述指標呈劑量依賴性降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組HRMEC中VEGF mRNA水平

2.4 Western Blot檢測在高糖環境下不同濃度迷迭香酸對HRMEC中VEGF蛋白表達的影響 與空白組及低糖組相比，在高糖環境下HRMEC中VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1各蛋白相對表達水平均明顯上升（均為P<0.05）；與高糖組相比，經不同濃度的迷迭香酸處理后HRMEC中 VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1各蛋白相對表達水平均顯著受到抑制，且迷迭香酸各劑量組上述蛋白水平呈劑量依賴性降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖3、4。

圖3 各組HRMEC中VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1蛋白水平

圖4 各組HRMEC中VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1蛋白電泳圖

3 討論

據流行病學統計，全世界范圍內糖尿病的患病率目前已經超過10%[10]，而在此基礎上發生血管并發癥的患者同樣在逐年增加，其中糖尿病視網膜病變是與糖尿病患者視力相關的最嚴重的特征性病變，是以血管通透性增強、微血管閉塞、組織缺氧、局部缺血為特征，刺激VEGF的形成與釋放，最終引起視網膜新生血管形成[11]。當發生視網膜病變時，由于新生血管內皮結構不穩定，易出現視網膜出血、水腫、積血等情況，如果不及時治療，50%的患者將在確診3～5年內完全喪失視力[12]。HRMEC在高糖環境下的氧化-抗氧化系統會出現紊亂，產生大量的活性氧[13]，從而破壞細胞的正常功能，同時其機體炎癥指標IL-1β、IL-6、TNF-α也會過表達[14]。目前臨床多通過藥物、激光及手術治療糖尿病視網膜病變，但由于其病理機制復雜，常用的治療方法難以滿足全部患者的需求，因此，目前仍迫切需要進行糖尿病視網膜病變的機制研究及靶向治療藥物的開發。

迷迭香酸是一種多酚酸，廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物中，是多種藥材和中成藥的主要成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多方面藥理學活性，且能夠在機體內相互聯系，共同發揮治療作用[15]。本研究結果發現，迷迭香酸能夠明顯抑制高糖環境下HRMEC的增殖活性，且隨著迷迭香酸濃度的增加，其抑制效果同樣增加。VEGF是參與視網膜損傷的主要標志指標，參與視網膜血管內皮連接與調節血管屏障功能[16]，本研究通過在高糖環境下培養HRMEC以模擬糖尿病視網膜病變微環境，RT-PCR結果顯示高糖環境下HRMEC中VEGF表達水平顯著上升，這與很多研究中高血糖能夠誘導HRMEC中VEGF過表達導致產生新生血管的結果一致[17，18]。此外，在一些關于神經系統的研究中發現，VEGF與神經元損害同樣具有緊密聯系[19]，可能加重糖尿病視網膜病變患者視力的進一步損害。FOXO3a轉錄因子已被證實具有抑制內皮細胞增殖分化成熟、遷移及新生血管形成的作用，且FOXO3a可以對血管內皮細胞中VEGF的表達從蛋白、mRNA和基因啟動子水平上發揮負調節作用，這一過程可能與FOXO3a通過與VEGF共同競爭轉錄激活因子FOXM1有關[20]，但當其發生磷酸化時會失去轉錄活性[21]。在本研究中，迷迭香酸能夠降低HRMEC中VEGF與FOXO3a的表達水平，且呈劑量依賴性，這可能與迷迭香酸能夠抑制FOXO3a磷酸化，從而抑制VEGF的促血管形成功能有關。

細胞周期在各個時期由不同周期蛋白調控，其中G0/G1期向S期轉化過程中主要由Cyclin A1與CDK2結合作用于檢查點，其結合復合物具有調節DNA合成與促進細胞分裂的作用[22]。流式細胞術結果顯示，高糖環境下HRMEC中周期調控蛋白Cyclin A1與CDK2的表達量顯著上升，且細胞周期多分布于S期，細胞增殖循環處于活躍狀態。PCNA在增殖細胞中于S期表達最高，G0/G1期表達量極低，因此能夠作為細胞增殖指標[23]。在本研究中，迷迭香酸能夠顯著降低高糖環境下HRMEC中Cyclin A1、CDK2與PCNA的表達，且將細胞周期進程阻滯于G0/G1期，使細胞增殖受到抑制，從而降低新的血管生成。

綜上所述，本研究通過建立高糖環境模擬糖尿病視網膜病變HRMEC微環境并應用迷迭香酸進行治療，發現迷迭香酸能夠通過對周期與增殖相關蛋白進行調控影響細胞周期進程，從而抑制HRMEC增殖導致的新生血管生成。本研究為開展糖尿病視網膜病變的中藥治療提供了新的思路與研究證據。