不同濃度的A-PRF 膜萃取液對人牙齦成纖維細胞增殖及OPG 表達的影響

陳嘉彤 王雪松 金鼎

隨著生活水平的提高,越來越多的人們開始重視口腔健康,人們的思想觀念也從治療為主轉向預防為主。越來越多的口腔材料都應用于臨床造福人類,A-PRF 膜也廣泛應用于口腔臨床診療工作中,它作為一種富含生長因子的生物膜因制取方法便捷、取自自體血液、離心無排斥反應等優點深受廣大醫生的喜愛,是一種天然纖維蛋白為基礎的生物材料,從不含抗凝劑的血液中收獲,無需任何人工生化修飾。A-PRF 膜對種植體周圍附著齦喪失具有很好的療效,可以很好的促進急性外傷造成的鼓膜創口的愈合,促進上頜竇的骨組織再生,也可以很好的治療牙周病導致的牙齦退縮［1-4］。A-PRF 膜還可以釋放大量的生長因子從而促進人牙齦成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原,有助于牙周組織的愈合［5］。Bozkurt 研究通過對20 例患者應用濃縮生長因子得出其有助于臨床上復雜性牙齦萎縮的治療［6］。本實驗采取健康成人靜脈血制作A-PRF 膜,將A-PRF 膜放置于患者自身體外培養的牙齦成纖維細胞培養瓶內,觀察各放置組內人牙齦成纖維細胞的生物學行為及各組內OPG 的表達,具體報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液(PBS)(Solarbio)、胰蛋白酶消化液(Solarbio)、DMEM 低糖培養基(Solarbio)、無噬菌體低內毒素胎牛血清(杭州四季青)、Vimentin(D21H3)XP Rabbit mAb(Cell Signaling Technology)、Goat anti-rabbit IgG(H+L)/FITC (Sigma,USA)、免疫熒光染色試劑盒(漢恒生物科技有限公司,上海)、OPG-ELISA 試劑盒(瑞齊生物科技有限公司,上海)、熒光顯微鏡 (正置,OLYMPUS)、SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、CKX41 顯微鏡、MCO-15A 全自動CO2細胞恒溫孵育箱(SANYO)、酶標儀(BioTek,synergy 2)。

1.2 方法

1.2.1 牙齦成纖維細胞的培養與組織來源鑒定 人的牙齦組織取材于本院口腔頜面外科門診因有阻生智齒需要拔除、矯正牙齒過程中開窗牽引需要切除少量牙齦,或者口腔種植手術中需切除部分牙齦且牙齦沒有炎癥的健康患者,在取得患者知情同意后選用其牙齦組織用作培養來源,年齡18～26 歲。將門診所選用的健康牙齦作為HGF 原代培養來源,利用牙齦組織塊貼壁的方法進行細胞培養,培養液需要每2～3 天做一次更換,采用普通光學顯微鏡觀察人牙齦組織塊的生長情況以及HGF 細胞的爬出形態。選擇胰蛋白酶消化傳代法消化并且提純人牙齦成纖維細胞［7］。利用免疫熒光染色的方法對健康傳代的第3 代細胞進行抗波形絲蛋白以及抗角蛋白染色鑒定細胞的來源。

1.2.2 制備A-PRF 膜萃取液并將A-PRF 膜與人牙齦成纖維細胞共同培養 A-PRF 膜制備方法：取2 份志愿者自身靜脈血10 ml,將其在無菌條件下進行離心,1500 r/min 離心14 min。見圖1。離心后取得A-PRF生長因子凝膠,將凝膠進行壓縮,制作A-PRF 膜。見圖2。將A-PRF 膜放置于存有5 ml 的DMEM 無菌培養基內進行孵育。1 周后將培養基內的培養液進行收集,隨后進行離心,采用無菌濾器進行過濾去除細菌,而后取得A-PRF 膜萃取原液。本實驗將這種原液濃度設定為100%濃度,而后用DMEM 培養基以不同濃度進行稀釋,從而獲得10%、50%的A-PRF 生長因子提取液。將第3 代人牙齦成纖維細胞用酶聯免疫法傳代到含有蓋玻片的六孔板內,取濃度0、10%、50%、100%的A-PRF 提取液100 μl 分別加入到人牙齦成纖維細胞培養基內,標記為A 組、B 組、C 組、D 組,每組內有7 個復孔。37℃的全自動CO2恒溫孵育箱內孵育24 h 后取出,倒置相差顯微鏡觀察人牙齦成纖維生物學形態。

圖1 自體血離心

圖2 制備A-PRF 膜

1.2.3 人OPG-ELISA 試劑盒檢測不同濃度PRF 膜對OPG 表達的影響 吸取不同組別培養基上清液置于離心管承裝并做好組別標記。依照OPG-ELISA 試劑盒使用說明進行操作。將標記好的稀釋標準品用酶標儀檢測各樣品孔的OD 值。從而利用各孔的吸光值得出相應樣品的OPG 含量的濃度。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗,多組比較采用方差分析。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人牙齦成纖維細胞的培養及鑒定 利用組織塊貼壁的培養方法培養HGF,組織塊貼壁。見圖3。在倒置相差顯微鏡下進行觀察,可見HGF 呈現梭形或者星形,細胞排列十分規則,呈束狀或旋渦狀。見圖4。用免疫熒光染色法鑒別HGF 組織的來源,抗角蛋白抗體染色結果無染色呈陰性,抗波形絲蛋白抗體染色呈現陽性,胞漿呈現熒光綠色,HGF 的細胞有明顯細長的偽足呈長梭形,胞核多呈橢圓形位于細胞的中央。見圖5。照相記錄HGF 的細胞形態,證實本實驗所培養的細胞為來源于中胚層的纖維母細胞,具有HGF 的形態特點。

圖3 培養的人牙齦成纖維細胞

圖4 培養的人牙齦成纖維細胞(×40)

圖5 牙齦成纖維細胞生物學形態的免疫熒光染色(×400)

2.2 不同濃度A-PRF 膜對牙齦成纖維細胞生長的影響 隨著A-PRF 膜萃取液濃度的增高牙齦成纖維生長密度增加,細胞數量明顯增多。見圖6。

2.3 不同濃度A-PRF 膜對人牙齦成纖維細胞OPG 表達的影響 HGF 在低濃度的生長因子萃取液刺激的條件下,OPG 表達水平隨著萃取液濃度的增高而不斷增加。經不同濃度A-PRF 膜萃取液刺激后,四組的OPG 表達水平比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表1,圖7。

表1 四組OPG 表達水平比較 (,pg/ml)

表1 四組OPG 表達水平比較 (,pg/ml)

注：四組比較,P<0.05

圖7 四組OPG 表達水平比較

3 討論

人牙齦成纖維細胞是牙周組織中的主體細胞,在牙周組織的保護及修復中占有重要的地位［8］。OPG 對骨組織吸收起抑制作用,抑制破骨細胞(OC)的分化、活化和成熟以及減少細胞數量［9］。本實驗選用人牙齦成纖維組織塊培養法體外培養HGF,原代培養的細胞以組織塊為中心呈放射狀增長,細胞繼續傳代呈旋渦狀或放射狀走行,排列十分緊密且有極性［10］。采用不同濃度的A-PRF 膜萃取液刺激人牙齦成纖維細胞,觀察其生物學形態變化及OPG 的表達。隨著A-PRF 濃度的增加人牙齦成纖維細胞的生長密度亦隨之增加,OPG 的濃度也相應增大,這使得真正具有溶骨作用的OC 數量大大減少,OPG 通過上述途徑起到了保護骨組織的作用。高濃度的A-PRF 膜萃取液可以通過支持促進細胞傳代增殖、釋放生長因子從而成為一種生物愈合基質［11］。有實驗研究表明A-PRF 膜可以通過增加堿性磷酸酶的分泌促進牙齦成纖維細胞的增殖與分化［12］,這與本實驗的研究結果相一致。A-PRF 膜通過活化成骨相關的基因RUNX2 及骨鈣素的表達促進HGF 的成骨過程［13］,這與本實驗OPG 隨萃取液濃度的增加而表達增強,共同證實了A-PRF 膜具有促進骨組織愈合的能力。種植體周圍炎的患者經過有效的潔治刮治等治療后應用A-PRF 膜還能有效的促進種植體周圍炎的愈合［14］。動物實驗研究A-PRF 可以有利于短期內外傷脫位牙牙周膜愈合［15］。A-PRF 膜可以刺激體外牙髓干細胞的增殖,對于一些需要進行牙髓血運重建的患兒聯合應用抗生素具有很好的療效［16,17］。A-PRF 膜內凝集的大量白細胞及生長因子也可以有效的治療拔牙創傷等原因引起的干槽癥［18］。Shivashankar 等［19］研究者對根尖周炎癥的患者進行根尖周骨組織手術并將A-PRF 膜及羥基磷灰石應用于術中骨缺損處,術后觀察治療效果穩定,促進新骨生成。Chandradas 等［20］也同樣應用A-PRF 膜治療骨缺損時發現其改善了臨床及放射影學參數。A-PRF 膜亦可促進上頜竇提升術竇底的骨組織愈合［21］。A-PRF 還常常應用于因慢性牙周炎牙齒拔除術后的位點保存,從而減輕牙槽骨吸收量。改良后的A-PRF 膜可以更多的釋放生長因子促進種植體周圍附著齦的生長,因此,無論是口腔種植、智齒拔除、外傷牙脫位,還是其他口腔頜面外科的有創創口,A-PRF 膜都能很好的促進牙齦組織及骨組織的愈合,為患者縮短療程減輕術后反應。

綜上所述,A-PRF 膜萃取液能夠很好的促進牙齦成纖維細胞的增殖,并且OPG 的含量也相應有所增加,更加證實了A-PRF 膜在促進牙齦組織愈合及骨組織愈合具有很好的貢獻。