法舒地爾調控Klotho抑制甲狀旁腺激素誘導的腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化研究

高子晴 崔彤霞

Klotho是近年發現的一種與衰老相關的蛋白，其主要在腎小管上皮細胞中表達。研究發現，不同原因引起的慢性腎臟病（Chronic kidney disease，CKD）均可導致Klotho表達下調，Klotho缺乏是CKD的早期表現，同時也加速CKD的進展[1]。現已證實甲狀旁腺激素（Parathyroid hormone，PTH）是慢性腎臟病患者體內的重要毒素之一，可引起軟組織及心血管鈣化等全身多系統損害，而Klotho可抑制AngⅡ的激活，減緩CKD的進程[2]，并可以增加血磷的排泄，進一步減少PTH的生成[3，4]。Strutz等[5]首次提出腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腎臟纖維化的重要因素之一，標志著CKD的結局，表現為上皮細胞在轉分化的過程中失去上皮細胞標志物（如E-cadherin），獲得間充質細胞標志物（如α-SMA）的高表達。近年研究證實，Rho/Rock信號通路是導致CKD腎臟纖維化的重要信號通路之一[6]。法舒地爾（Fasudil）是體內或體外實驗使用最為普遍的Rho/Rock信號通路抑制劑，為研究用法舒地爾抑制或減輕PTH誘導的CKD提供了理論依據[7]，但是否可以通過提高Klotho的表達來減輕PTH引起的EMT尚未見報道。本研究擬觀察不同濃度法舒地爾對PTH誘導的人腎小管上皮細胞EMT中Klotho表達的影響，以探討Klotho及法舒地爾在慢性腎臟病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人腎小管上皮細胞HK-2（美國ATCC，CRL-2190TM）；DMEM培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素（美國Gibco）；上皮細胞生長因子（美國Peprotech）；法舒地爾注射液（天津紅日藥業股份有限公司，規格30mg/2ml）；PTH 1-34（美國Sigma）；α-SMA抗體、E-cadherin抗體、Klotho抗體（美國Santa），PBS溶液（美國Gibco），定量PCR試劑盒（瑞士Roche），Total RNA提取試劑（美國Invitrogen Life Technologies），BCA蛋白定量檢測試劑盒（美國Bio-rad）；Actin（美國CST）。

1.2 實驗分組 原代腎小管上皮細胞在上皮細胞培養基（胎牛血清10ml，上皮細胞生長因子1ml，青霉素/鏈霉素1ml，加入88ml基礎培養基中）培養下傳代，取第3代上皮細胞用于實驗，實驗分為5組，分別為：空白對照組（C組）：腎小管上皮細胞不作任何處理；T1組：PTH（10-10mol/L）+法舒地爾（0μmol/L）；T2組：PTH（10-10mol/L）+法舒地爾（10μmol/L）；T3組：PTH（10-10mol/L）+法舒地爾（20μmol/L）；T4組：PTH（10-10mol/L）+法舒地爾（30μmol/L）。培養時間為48h。

1.3 實驗方法

1.3.1 Western-blot檢測Klotho蛋白的表達 培養48h后，用TBS緩沖鹽水沖洗腎小管上皮細胞3次，在培養皿中加入RIPA裂解緩沖液，通過反復搖動使試劑與細胞充分混合，用細胞刮刀將細胞刮下來并收集。細胞裂解液（30μg）在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳并將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，與驢抗鼠抗體（0.2μg/ml）、驢抗兔抗體（0.2μg/ml）作為內部對照進行雜交，然后用1μg/ml抗驢免疫球蛋白G-過氧化物結合物對條帶進行掃描測量其強度，使用數字凝膠電泳圖像處理和分析系統進行檢測。

1.3.2 RT-PCR檢測E-cadherin、α-SMA及Klotho mRNA表達 培養48h后，用Trizol試劑從腎小管上皮細胞分離出總RNA。進行RT-PCR分析，用反轉錄酶和oligo dT引物從1μg總RNA中合成cDNA，體積為10μl，用Tris/EDTA緩沖液將反應混合物調整為50μl，用于PCR分析。cDNA擴增反應混合物最初在95℃溫育30s以使DNA變性；擴增進行40個循環，95℃5s，60℃34s。RTPCR在以下條件下進行，95℃2min，然后進行40個循環，95℃35s，60℃1min，72℃2min，通過熔解曲線分析，用肌動蛋白作為內源性控制基因對數據進行處理。使用引物：E-cadherin：上游5'-CCGGGACAACGTTTATTACTAT-3'，下游5'-CATA GTCAAACACGAGCAGAGAAT-3'；α-SMA：上游5'-CTTGAGAAGAGTTACGAGTTGC-3'，下 游5'-GATGCT GTTGTAGGTGGTTTC-3'；Klotho：上游5'-ACAATACT TCTTTCCGTCCCACT-3'，下游5'-GAGCAAAAAAGTC AGCAGTTCCT-3'；Actin：上游5'-CACCCAGCACAAT GAAGATCAAGAT-3'，下游5'-CCAGTTTTTAAATCCT GAGTCAAGC-3'。根據2-△△Ct方法計算相對表達率。

1.4 統計學分析 采用SPSS 21.0統計軟件分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多個樣本均數兩兩之間比較采用LST-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學改變 倒置顯微鏡下觀察，正常腎小管上皮細胞呈圓形或類圓形，排列如鋪路石樣，經PTH刺激后不同程度地拉長，變為長梭形或不規則形，胞間連接變松散，排列呈索條狀。外源性給予法舒地爾后，上皮細胞發生EMT的細胞數量減少，見圖1。

圖1 細胞形態學改變

2.2 Western-blot檢測結果 T1組在PTH的刺激下Klotho蛋白表達明顯減少；而在法舒地爾干預下，T2～T4組Klotho蛋白表達明顯增多，并且隨著法舒地爾的濃度增高，Klotho蛋白水平逐漸升高，T3組達到峰值，T4組與T3組相比稍有下降，見圖2。

圖2 各組Klotho蛋白的表達

2.3 RT-PCR檢測結果 T1組在PTH刺激下Klotho mRNA表達明顯減少。而在法舒地爾的干預下，與T1組相比T2～T4組Klotho mRNA表達明顯增強（P<0.05），并且隨著法舒地爾的濃度增高，Klotho mRNA表達水平逐漸升高，T3組達到峰值，T4組稍有下降，但與T3組相比差異無統計學意義（P>0.05）。與C組相比，T1～T4組E-cadhernin mRNA表達明顯下降，α-SMA mRNA表達明顯增加，尤其以T1組最為顯著（P<0.05）。在T1～T3組，隨著法舒地爾濃度增高，E-cadhernin mRNA表達量逐漸上升，α-SMA mRNA表達量逐漸下降，T3組達到峰值，T4組稍有所下降，但T3、T4組差異無統計學意義（P>0.05），各組與T1組相比差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組E-cadherin、α-SMA、Klotho mRNA水平比較（±s）

表1 各組E-cadherin、α-SMA、Klotho mRNA水平比較（±s）

注：與T1組比較，*P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05

項目 C 組 T1組 T2組 T3組 T4組α-SMA mRNA 0.901±0.015* 2.278±0.116Δ 1.811±0.364*Δ 1.300±0.083*Δ 1.402±0.127*Δ E-cadherin mRNA 1.493±0.011* 0.295±0.007Δ 0.824±0.032*Δ 1.186±0.097*Δ 1.092±0.027*Δ Klotho mRNA 1.207±0.029* 0.362±0.016Δ 0.882±0.101*Δ 1.291±0.091*Δ 1.212±0.038*Δ

3 討論

腎小管EMT是腎臟成纖維細胞的主要來源，在腎臟纖維化的發生與進展中起著重要作用，其中PTH是促進EMT的重要細胞因子。Klotho蛋白是近年研究發現的一種與衰老相關的蛋白，其主要在腎小管上皮細胞中表達。有研究表明，在腎臟損傷情況下，Klotho蛋白表達下調，而該蛋白表達下調促進了腎臟損傷，導致Klotho蛋白進一步下降，通過提高內源性Klotho蛋白表達或增加外源性Klotho蛋白可緩解及阻止腎臟疾病的發生發展，說明Klotho蛋白不僅是早期腎損傷的標記物，更是保護因子[8，9]。法舒地爾是唯一用于臨床的Rho/Rock信號通路選擇性抑制劑[10]，可以減少蛋白尿和腎小球系膜外基質堆積，減輕腎小球硬化和腎間質纖維化等[11～13]。基于此，本實驗研究Rho/Rock信號通路抑制劑法舒地爾對PTH誘導人腎小管上皮細胞EMT中Klotho蛋白表達的影響，可能有助于尋找防治腎臟纖維化的新靶點。

本研究在倒置顯微鏡下觀察正常腎小管上皮細胞形態，呈圓形或類圓形，排列如鋪路石樣，不雜亂；而加入PTH后，腎小管上皮細胞呈不同程度的拉長，變為長梭形或不規則形，胞間連接變松散，排列呈索條狀，呈典型的纖維樣改變。在法舒地爾的干預下，發生形態改變的細胞數量明顯減少，EMT明顯減輕。說明PTH可以誘導EMT，而外源性給予法舒地爾可明顯減輕纖維化程度，減少腎小管上皮細胞損傷，進一步延緩CKD進程。

通過Western-blot和RT-PCR檢測Klotho蛋白和mRNA的表達結果顯示，T1組在PTH刺激下Klotho mRNA和蛋白表達明顯減少，而在法舒地爾的干預下，T2～T4組Klotho mRNA和蛋白表達明顯增強，并且隨著法舒地爾的濃度增高，Klotho mRNA和蛋白水平逐漸升高，其中法舒地爾在20μmol/L時作用最顯著，并且T3、T4組Klotho mRNA表達水平均高于C組，說明在PTH誘導的腎小管上皮細胞EMT過程中，腎小管上皮細胞內源性Klotho表達明顯減少，而在Rho/Rock信號通路抑制劑法舒地爾的干預下，腎小管上皮細胞EMT程度減輕，并可同時誘導人腎小管上皮細胞內源性Klotho表達增高，更進一步減輕EMT。隨著Klotho的表達增加，上皮細胞標志物E-cadherin表達上調，間充質細胞標志物α-SMA表達下調，標志著EMT程度減輕，也從另一個角度說明在法舒地爾的干預下，上調Klotho的表達可減緩EMT的發生、發展。提示Klotho在腎臟纖維化發生、發展過程中起著重要的保護作用。但是關于Klotho的傳導通路、對腎臟的具體保護作用機制及PTH、Rho/Rock信號通路誘導EMT的機制等尚需進一步研究。

綜上所述，法舒地爾在PTH誘導的人腎小管上皮細胞EMT中，可能通過上調Klotho表達減緩EMT的發展。