人胎腦來源神經干細胞移植后的致瘤性研究

尹玉柱 梁久紅

干細胞是一類具有長期（或無限）自我更新、增殖及多向分化潛能，能產生某種（或多種）特殊功能細胞的原始細胞，它是生命起源、組織器官發育和損失后再生修復的基礎，具有重要的研究和應用價值。自1951年至今，干細胞研究在血液系統疾病、免疫系統疾病、腫瘤、糖尿病、腸炎、代謝性疾病、肝病、急重癥感染以及神經系統疾病等方面取得了一定成果[1～9]，但在腦、脊髓等神經系統疾病方面進展比較緩慢，可能與人神經干細胞獲得、提存、培養、擴增及應用途徑和安全系數等有關。神經系統（尤其是中樞神經）損傷和退化，最終要由神經干細胞來解決。有研究用人類胚胎干細胞來源的少突先驅膠質細胞治療頸脊髓損傷大鼠，注入該細胞1周后，大鼠的運動能力恢復至正常大鼠的97%[10]；2017年國內學者開展了人胚胎干細胞來源的神經前體細胞治療帕金森病、人胚胎干細胞來源的視網膜色素上皮細胞治療干性年齡相關性黃斑變性的臨床研究[11]。上述研究均未采取直接移植人胎腦神經干細胞，因有證據顯示人胚胎干細胞植入裸鼠體內能夠形成畸胎瘤[12]。異體人胎腦神經干細胞（即來源于新鮮棄胎的胎腦神經組織）移植后是否有致瘤性、是否會發生異體免疫排斥反應等問題仍未明確。本研究探討移植原代人胎腦神經干細胞后是否具有致瘤性，以期為其下一步臨床試驗和應用的安全性及可行性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

1.1.1 細胞系 來自于人胚胎發育早期階段的原代胎腦神經干細胞由吉林大學通源生物工程有限公司提供，細胞劑量1×108個/ml。Hela細胞由華東師范大學生命醫學研究所提供。

1.1.2 實驗動物 8周齡的免疫缺陷小鼠BALB/c，來源于華東師范大學實驗動物中心，實驗前常規適應飼養1d。

1.1.3 主要試劑及器材 杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）購自Gibco公司，HE染色試劑盒（Giemsa）、0.9%氯化鈉注射液購自上海百特醫療用品有限公司，恒溫箱（江蘇恒創實驗設備有限公司），流式細胞儀（BD公司，BD FACSCaliburTM Flow Cytometer）。

1.2 試驗方法 實驗分為3組：實驗組、Hela細胞陽性對照組及DPBS陰性對照組，每組20只小鼠（雌雄各10只）；注射方式為肋部皮下單次注射，注射體積為0.2ml/只，實驗組注射原代人胎腦神經干細胞2×107個/只，Hela細胞陽性對照組注射Hela細胞1×106個/只，DPBS陰性對照組注射DPBS 0.2ml/只。每天觀察小鼠行為活動、腺體分泌、糞便形態及體表粘膜等一般生理指標并記錄。于注射后第1、2、3、6個月對部分小鼠注射部位進行病理切片檢查（HE染色），每次每組隨機解剖5只，以確定其是否發生瘤變，記錄結果。

1.3 統計學分析 使用SPSS 20.0統計學軟件對所得數據進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般狀態觀察 在注射后6個月內，實驗組和DPBS陰性對照組小鼠精神及行為活動、腺體分泌、糞便形態、體表粘膜等均無明顯變化；Hela細胞陽性對照組小鼠在注射Hela細胞1個月左右陸續出現精神較差、行動遲緩、糞便成黃褐色伴不成形等，個別小鼠眼睛有眼屎。

2.2 小鼠注射部位觀察、病理切片及HE染色 通過注射后6個月的觀察，實驗組與DPBS陰性對照組小鼠肋部皮下注射點位置均無腫塊或瘤體形成；Hela細胞陽性對照組所有小鼠在注射后2周左右肋部皮下注射點部位逐漸有瘤體形成，1個月左右在注射部位有明顯的瘤塊形成，2個月后注射部位可見1～1.2cm3的瘤組織生成。將注射后2個月的小鼠處死，取注射部位組織進行病理切片和HE染色（見圖1），DPBS陰性對照組和實驗組均呈現正常皮膚組織形態學結構，胞體豐富、束狀排列；而Hela細胞陽性對照組則呈現典型的瘤組織結構，細胞致密、無規則排列。第3個月、第6個月的病理切片和HE染色結果與第2個月相同。

圖1 注射后2個月小鼠注射部位病理切片

2.3 小鼠注射部位瘤變情況比較 與注射前相比，在注射后6個月內，實驗組和DPBS陰性對照組小鼠一般狀態的變化率為0，注射部位成瘤/成腫塊率為0；Hela細胞陽性對照組小鼠一般狀態的病態變化率為100%，注射部位成瘤率為100%，差異具有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

人類是多細胞物種，人體由數以百萬億計的細胞構成。人體的所有行為活動、生理狀態以及病理變化，都是細胞狀態和功能變化的具體體現。疾病是某些細胞衰老、病變的綜合反應。人類細胞是有壽命的，是有限資源，所以人體要經過生老病死過程，而這個過程是由自體先天性固有干細胞資源決定的。細胞包括干細胞和終末分化的各種功能細胞，所有細胞都來源于干細胞。干細胞是人體生長發育、維持新老細胞穩態更新以及組織/器官再生、修復的基礎，但人類干細胞的壽命也是有限的，遵循增齡、增代性衰減的自然規律，所以，補充（即移植）異體干細胞無疑是防治疾病、抗衰、延長生命的一種可期選擇。神經干細胞更是如此，人體出生時為神經系統（尤其是腦、脊髓等中樞神經）預留的干細胞極其有限，這是導致臨床上神經系統疾病難以治愈的關鍵因素或根本原因。移植人異基因個體神經干細胞，以補充其不足，提高神經系統的再生修復能力，是從根源上防治神經系統各種疾病的根本方法。但其最大障礙是移植干細胞的致瘤性，以及與受體之間的免疫排斥反應問題。之前已有成體神經干細胞致瘤性的相關研究[13，14]，但其取材、傳代、擴增以及應用等明顯受限；本研究以人胎腦來源的原代神經干細胞（即胚胎神經干細胞）為研究對象，探討其移植后的致瘤性，從而為解決可臨床應用的人神經干細胞資源匱乏，預防和治療神經系統疾病（尤其是小兒腦癱，神經損傷，腦/脊髓增齡性、退行性改變等）提供新思路。

可用于移植的不同來源人神經干細胞各具優缺點：①自體干細胞：屬于成體神經干細胞范疇，優點是無免疫排斥反應；缺點是呈增齡、增代性功能老化的生物學特性，而非神經干細胞轉分化成可用的神經干細胞難度極大。②誘導性多能干細胞（iPSCs），屬于人工重編輯的干細胞，無倫理道德問題，不需要HLA配型，但有成活性低、有效性和可控性不確定、有致瘤性和脫靶性等風險。③異基因/異體神經干細胞：成體神經干細胞，包括成人骨髓源性神經干細胞、傳數代后的干細胞及其誘導分化的功能細胞、體外誘導性轉分化的神經干細胞等，其取材、傳代、擴增以及時效性等方面明顯受限，需要HLA配型，否則移植后易發生異基因免疫排斥反應等問題，風險系數高。人胎腦神經干細胞，來源于孕4～12周、其父母已經放棄、非病理性流產的新鮮棄胎，吉林大學通源生物工程有限公司通過獨特的干細胞分離純化、培養、鑒定等技術獲取，經免疫學、微生物學以及分子生物學等檢測合格，具有自我更新、增殖能力強以及極低免疫原性等生物學特性，移植可不需嚴格的HLA配型。本研究選用的是原代干細胞，免去了因培養、傳代等可知或不可知因素的影響，實驗結果更趨客觀、真實。結果顯示：Hela細胞陽性對照組具有顯著的成瘤性，而實驗組移植的人胎腦神經干細胞與DPBS陰性對照組結果一致，無致瘤/成瘤性。人胎腦神經干細胞的移植與應用比較安全，有較強的可行性，但其作用機制尚不明確，可能為：①通過細胞間接觸調節免疫細胞，或分泌可溶性細胞因子、SC-EVs等發揮免疫調節和免疫抑制功能[15～17]；②通過分泌細胞因子、外泌體或細胞間接觸，調節和激活受體自身的休眠干細胞及（或）老代干細胞，增殖、分化產生新功能細胞，進行細胞更新、組織再生與修復；③通過干細胞替代機制，即人胚胎神經干細胞因免疫原性極低、免疫耐受而存活，并能夠如同受體自體干細胞一樣進行自我復制、增殖、分化，產生相應的健康功能細胞，以補充和更新替換衰老、病變細胞，恢復或重建神經網絡。

綜上所述，人胎腦神經干細胞可能參與和提升受體神經組織的穩態更新、再生修復過程，有望解決臨床及科研中人神經干細胞資源匱乏等難題。但也有因實驗裸鼠數量不足以及選取的人胎腦神經干細胞發育階段不同等因素而出現致瘤風險的可能，之后我們將進行人胎腦來源神經干細胞致瘤性的分子遺傳學研究來進一步驗證。同時，人胚胎干細胞的倫理道德和應用標準等問題亦亟待解決。