莖瘤芥BjuEAR1-1的克隆與表達分析

程春紅，游經番，蔡兆明，葉春宏，陳 麗

(長江師范學院 生命科學與技術學院，重慶 408100)

莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumidaTsen et Lee)隸屬雙子葉植物綱十字花科蕓苔屬。莖瘤芥的莖在生長發育的過程中會呈瘤狀膨大，而它膨大的瘤狀莖正是制作榨菜的主要原料。榨菜在我國涪陵盛產，是我國出口國外的世界級名腌菜。涪陵是莖瘤芥主產區，被譽為我國“榨菜之鄉”[1-2]。然而，莖瘤芥在生長過程中常受到霜凍、鹽漬化和干旱等非生物逆境脅迫的影響，嚴重制約榨菜的產量和質量。因此，挖掘莖瘤芥抗逆基因、創制耐逆穩產的莖瘤芥新品種迫在眉睫。

植物在生長發育過程中具有不可移動性，易受自然環境的影響，導致植物的生長發育受阻，產量下降。鹽脅迫導致植物生長率降低、生長發育減緩、植株矮小、葉片干枯等。植物主要通過根系來實現養料的吸取和與外界的物質交換，植物遭受鹽脅迫時，土壤鹽分升高，水分減少，根系吸水能力下降，從而導致植物根系細胞滲透壓下降[3]。鹽脅迫也影響種子萌發，鹽分濃度相對較低時植物種子的萌發率較高，而與之相反，鹽分濃度較高時植物種子的萌發率較低[3-5]。

溫度脅迫主要以低溫脅迫為主，溫度降低會使植物的產量也隨之下降，有時甚至過低的溫度還會使植物直接死亡。研究表明，低溫脅迫造成植物體內葉綠體的亞顯微結構發生改變和酶活性改變，直接影響植物的能量代謝，而植物的能量代謝又與植物的光合作用相關，所以低溫環境將會給植物的光合作用帶來影響，從而使植物光合作用速率下降。與此同時，低溫脅迫也會影響植物的呼吸作用[6-7]。

脫落酸(Abscisic acid，ABA)參與植物休眠、脫落和種子萌發等生理過程，在植物對外界環境脅迫的響應中也起著極其重要的作用，如鹽脅迫、低溫、滲透壓脅迫等非生物脅迫[8-11]。在非生物脅迫下植物激素脫落酸(ABA)可以通過促使植物落葉、氣孔關閉和產生抗逆蛋白等方式來增強植株對非生物逆境脅迫的抵御能力，在植物抗逆過程中，ABA信號通路發揮重要作用[12-13]。在ABA核心的信號通路中，主要含有4個組分，即ABA受體PYR1/PYLs/RCARs、A類蛋白磷酸酶PP2C( Protein phosphatase 2C)、蛋白激酶SnRKs以及下游ABA響應因子如ABI5等[14-15]。當植物遭受逆境脅迫時，植物體內大量合成ABA，ABA與其受體結合并抑制蛋白磷酸酶PP2C的活性，從而釋放對蛋白激酶SnRK2的抑制，蛋白激酶磷酸化下游的轉錄因子，從而調控ABA響應基因的表達，ABA信號通路開啟，調節植物對逆境脅迫的響應[16-17]。

在擬南芥中研究表明，EAR1(ENHANCER OF ABA CO-RECEPTOR 1)在ABA信號通路中起著負調控作用，其突變體ear1-1在氣孔運動、種子萌發以及幼苗根生長方面都表現出對ABA更為敏感的表型，表明EAR1在調控植物對外界非生物逆境脅迫的響應中具有重要作用[18-19]。

本研究在莖瘤芥中篩選到擬南芥EAR1的同源基因BjuEAR1-1以及BjuEAR1-2。對BjuEAR1-1以及BjuEAR1-2的CDS序列進行PCR擴增，可以擴增到BjuEAR1-1的CDS序列，因此，本研究將采用酶切酶連載體構建方法構建植物過表達載體 35S∷PTF101-GFP-BjuEAR1-1，采用煙草葉片瞬時轉化技術對其編碼蛋白的亞細胞定位進行分析，并對其啟動子順式作用元件進行分析，以及采用熒光定量PCR技術分析BjuEAR1-1在非生物逆境脅迫和不同組織器官中的基因表達模式。研究結果將初步明確BjuEAR1-1在莖瘤芥抗逆過程中的功能，為進一步探究BjuEAR1-1的生物學功能奠定研究基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所需的莖瘤芥主栽品種永安小葉和本氏煙草由重慶市長江師范學院提供，KOD FX高保真酶購自TOYOBO公司。RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒、PCR產物回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自杭州新景生物試劑開發有限公司。限制性內切酶購自賽默飛世爾(中國)有限公司。

1.2 試驗材料的培養

以永安小葉為試驗材料，對田間生長的莖瘤芥(六葉期，生長1.5月苗)進行取樣，所取樣品為莖瘤芥的根、莖和葉；對田間生長的莖瘤芥(膨大旺盛期，生長4.5月苗)進行取樣，所取樣品為莖瘤芥的膨大瘤莖；對田間生長的莖瘤芥(抽薹開花期，生長5.5月苗)進行取樣，所取樣品為莖瘤芥的花和種莢。將生長條件為16 h/8 h(光照/黑暗)，22 ℃的培養室中在MS培養基上生長7 d的莖瘤芥幼苗施加低溫(4 ℃)、50 μmol/L ABA和100 mmol/L NaCl 3種逆境脅迫處理，3 h后進行取樣，設置對照試驗(水處理3 h)。低溫處理即將莖瘤芥幼苗貼苗至鋪有濾紙的培養皿中(水充分浸濕濾紙)，分別置于培養室和4 ℃冰箱中，3 h后進行取樣；50 μmol/L ABA處理即將莖瘤芥幼苗貼苗至鋪有濾紙的培養皿中(分別用水和50 μmol/L ABA溶液充分浸濕濾紙)，置于培養室中，3 h后進行取樣；100 mmol/L NaCl處理即將莖瘤芥幼苗貼苗至鋪有濾紙的培養皿中(分別用水和100 mmol/L NaCl溶液充分浸濕濾紙)，置于培養室中，3 h后進行取樣。采用錫箔紙取樣，將各個處理的莖瘤芥幼苗迅速吸干水分后在液氮中速凍后置于-80 ℃條件下保存，以便后續基因表達分析使用。

1.3 試驗方法

1.3.1BjuEAR1-1基因克隆及載體構建 在蕓薹屬數據庫(http://brassicadb.cn/#/)中下載BjuEAR1-1基因序列(BjuB013004)，其蛋白編碼序列CDS長度為1 410 bp。參照BjuEAR1-1基因片段以及35S∷PTF101-GFP載體多克隆位點兩側序列，在軟件Primer 5上對BjuEAR1-1基因序列進行引物設計，上游引物Primer F(SmaⅠ雙下劃線所示序列)：CCCGGGATGATGGCTTGTGGCTTAAGCAAG(雙下劃線所示序列為限制性酶切位點)；下游引物Primer R(BamH Ⅰ)：GGATCCTGAAGTGGCAATGCAAAAAGCCTC(雙下劃線所示序列為限制性酶切位點)，送至華大基因進行引物合成。使用艾德萊生物的EASY spin植物RNA快速提取試劑盒按其說明進行永安小葉的RNA提取，接著使用艾德萊生物的TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser試劑盒按其說明對提取的永安小葉RNA進行反轉錄得到cDNA，最后以cDNA為模板進行PCR擴增，使用上海生工生產的膠回收試劑盒進行PCR產物的純化回收，將BjuEAR1-1的CDS序列連接到T載體。提取測序正確的BjuEAR1-1-T與大載體35S∷PTF101-GFP質粒，對BjuEAR1-1-T與大載體35S∷PTF101-GFP質粒進行雙酶切，選用Thermo Scientific Fast Digest快切酶進行酶切反應。按照T4DNA連接酶體系進行連接反應，連接產物轉化大腸桿菌 DH5α感受態，菌落PCR和酶切鑒定正確后，35S∷PTF101-GFP-BjuEAR1-1載體構建完成。

1.3.2 莖瘤芥BjuEAR1-1蛋白亞細胞定位分析 將構建成功的35S∷PTF101-GFP-BjuEAR1-1載體轉化到農桿菌GV3101菌株中，將鑒定正確的菌株在28 ℃條件下搖培過夜，3 000 r/min離心10 min收集菌體。10 mmol/L MgCl2重懸菌體，吹吸混勻后，3 000 r/min離心10 min，棄掉上清液。用10 mmol/L MgCl2重懸菌體，至OD600=0.2～0.3，加AS至終濃度為200 μmol/L，室溫下靜置2 h。挑選煙草植株中部較大符合浸染條件的葉片，將注射器拔掉針頭吸取菌液，選擇無主葉脈的位置，緩慢注射轉化菌液。注射后的煙草在光下繼續培養48 h后，用熒光顯微鏡觀察煙草表皮細胞，確定BjuEAR1的亞細胞定位情況。

1.3.3 啟動子順式作用元件分析 選取BjuEAR1-1基因序列ATG上游2 kb片段作為啟動子序列，采用New PLACE(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action=newplace)在線啟動子分析軟件，對莖瘤芥BjuEAR1-1基因啟動子上的順式作用元件進行分析。

1.3.4BjuEAR1-1在不同組織器官中表達模式分析 為探究BjuEAR1-1在莖瘤芥中的組織器官表達模式，對莖瘤芥的不同組織器官即根、莖、葉、花、種夾和膨大莖進行RNA提取，反轉錄為cDNA，采用熒光定量PCR技術分析BjuEAR1-1基因在不同組織器官中的時空表達模式，以BjuACTIN3作為內參基因，試驗進行3次生物學重復，每次每個樣品3次重復。

1.3.5BjuEAR1-1在非生物逆境脅迫處理下表達模式分析 為驗證BjuEAR1-1是否參與調控莖瘤芥對逆境脅迫的響應，對萌發7 d的莖瘤芥(永安小葉)幼苗分別施加低溫(4 ℃)、50 μmol/L ABA和100 mmol/L NaCl的脅迫處理，并于處理后3 h取樣，將從莖瘤芥中提取得到的RNA進行反轉錄成為cDNA后，通過熒光定量PCR檢測BjuEAR1-1基因表達情況，從而分析BjuEAR1-1在逆境脅迫處理下的表達模式。

2 結果與分析

2.1 莖瘤芥BjuEAR1-1基因的克隆及載體構建

提取莖瘤芥(永安小葉)總RNA，反轉錄得到cDNA后，通過PCR技術擴增得到BjuEAR1-1目的片段(圖1-A)，回收純化目的片段連接到T載體上，將連接產物轉化入大腸桿菌感受態DH5α(圖1-B)，將轉化子用2×Taq Master Mix進行菌落PCR鑒定，選取2～3個陽性重組克隆進行序列測序(圖1-C)。選擇相應的限制性內切酶分別對測序成功的BjuEAR1-1-T載體及目的載體35S∷PTF101-GFP進行雙酶切，回收酶切后的目的片段和線性化目的載體(圖2-A)，用T4DNA連接酶連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α后對抗性平板上長出的陽性克隆菌落進行菌落PCR擴增鑒定(圖2-B)，將PCR陽性單克隆搖培過夜。收集培養后的菌體提取質粒，進行酶切鑒定，能夠切下目的條帶說明載體構建成功(圖2-C)。

A.莖瘤芥BjuEAR1-1基因CDS序列擴增結果圖：M.DL2000 DNA Marker；1—2.BjuEAR1-1基因CDS序列擴增。B.BjuEAR1-1-T轉化子平板篩選圖。C.BjuEAR1-1-T菌落PCR鑒定圖：M.DL2000 DNA Marker；1—6.BjuEAR1-1-T菌落PCR鑒定結果。

A.BjuEAR1-1-T和35S∷PTF101-GFP雙酶切后目的片段膠回收檢測圖：M.DL2000 DNA Marker；1—2.BjuEAR1-1-T雙酶切后目的片段回收；3.35S∷PTF101-GFP雙酶切后目的片段回收。B.35S∷PTF101-GFP-BjuEAR1-1菌落PCR檢測：M.DL2000 DNA Marker；1—6.菌落PCR凝膠檢測。C.35S∷PTF101-GFP-BjuEAR1-1酶切鑒定：M.DL2000 DNA Marker；1—4.35S∷PTF101-GFP-BjuEAR1-1質粒酶切鑒定。

2.2 莖瘤芥BjuEAR1-1蛋白亞細胞定位分析

將構建成功的35S∷PTF101-GFP-BjuEAR1-1表達載體轉化到農桿菌感受態GV3101菌株中，對陽性單克隆進行PCR鑒定，篩選可以擴增到目的條帶的陽性單克隆。利用農桿菌介導的煙草葉片瞬時轉化技術，在煙草葉片中觀察BjuEAR1-1蛋白亞細胞定位情況，結果表明，在煙草細胞的細胞核和細胞質中均能檢測到綠色熒光信號，表明BjuEAR1-1在細胞核和細胞質中發揮生物學功能(圖3)。

圖3 BjuEAR1-1蛋白亞細胞定位分析Fig.3 Subcellular localization analysis of BjuEAR1-1

2.3 莖瘤芥BjuEAR1-1啟動子順式作用元件分析

為了研究BjuEAR1-1基因在莖瘤芥中的功能，選取BjuEAR1-1基因序列ATG上游2 kb片段作為啟動子序列，對莖瘤芥BjuEAR1-1基因啟動子上的順式作用元件進行分析，結果如圖4所示，在BjuEAR1-1啟動子上含有干旱響應元件MBS、MYBATRD22和LTRECOREATCOR15，脫水響應元件ACGTATERD1，鹽脅迫響應元件GT1GMSCAM4，脫落酸響應元件ABRE、MYB2CONSENSUSAT、MYB1AT和DPBFCOREDCDC3，赤霉素響應元件WRKY71OS、MYBGAHV、GAREAT和GARE1OSREP1，生長素響應元件SURECOREATSULTR11，乙烯響應元件ERELEE4，茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif和TGACG-motif(圖4)。研究結果表明，BjuEAR1-1基因可能既參與了非生物脅迫的響應又參與了植物激素應答。

圖4 BjuEAR1-1啟動子順式作用元件分析Fig.4 The cis-acting elements analysis of BjuEAR1-1 promoter

2.4 莖瘤芥BjuEAR1-1組織器官表達模式分析

利用熒光定量PCR法對BjuEAR1-1在莖瘤芥不同發育階段的根、莖、葉、花、種莢和膨大莖中的表達模式進行分析，結果如圖5所示。由圖5可知，BjuEAR1-1在不同組織器官中均有表達，并且在根、莖、葉和種莢中的表達水平非常高，然而在膨大莖中表達量卻很低。說明BjuEAR1-1可能調控瘤莖的膨大。

不同小寫字母表示各個處理之間在0.05顯著水平上存在顯著性差異。圖6同。The different normal letters indicate significant difference between treatments at the 0.05 level.The same as Fig.6.

2.5 莖瘤芥BjuEAR1-1在不同脅迫處理下基因表達模式分析

對萌發7 d的莖瘤芥(永安小葉)幼苗分別施加低溫(4 ℃)、50 μmol/L ABA和100 mmol/L NaCl的脅迫處理，在處理后3 h進行取樣，提取莖瘤芥的RNA反轉錄成為cDNA后，進行熒光定量PCR檢測BjuEAR1-1基因表達情況。由圖6可知，與對照組相比，ABA和低溫均能顯著誘導BjuEAR1-1表達(P<0.05)，而NaCl處理下BjuEAR1-1的表達水平與對照組沒有顯著差異。表明莖瘤芥BjuEAR1-1的表達受ABA和低溫的顯著誘導。

圖6 不同脅迫處理下BjuEAR1-1的表達分析Fig.6 Expression analysis of BjuEAR1-1 under different stresses treatment

3 結論與討論

本研究在莖瘤芥中克隆獲得一個新的基因，根據生物信息學的分析，該基因屬于EAR1家族，因此將其命名為BjuEAR1-1。BjuEAR1-1在擬南芥中的同源基因為AT5G22090，根據以往的研究結果，AT5G22090在植物抗逆過程中起著重要作用，而BjuEAR1-1是其在莖瘤芥中的同源基因，由此推測BjuEAR1-1在莖瘤芥抗逆過程中也具有一定的生物學功能。

啟動子順式作用元件的存在可以為基因在轉錄水平上調控機制的研究提供線索。如水稻轉錄因子OsOFP家族基因的組織表達分析表明，該家族基因可能參與水稻生長發育的全過程，特別是種子發育的調控[20]。本次試驗對BjuEAR1-1基因啟動子上順式作用元件進行分析，發現啟動子區含有參與應答脫落酸反應的順式作用元件，表明該基因的表達可能受ABA的調控。此外，還發現了赤霉素應答元件、乙烯響應元件等，表明了BjuEAR1-1基因可能在激素信號通路中扮演著重要的角色。同時BjuEAR1-1基因的啟動子區域中還有與逆境脅迫相關的順式作用元件，表明該基因可能參與植物對非生物脅迫的響應。進而對BjuEAR1-1在不同脅迫處理下的基因表達模式進行了分析，研究發現，低溫和ABA均能誘導該基因顯著表達，表明BjuEAR1-1在莖瘤芥響應非生物逆境脅迫過程中具有一定的生物學功能。

榨菜的原材料來自莖瘤芥的膨大莖，且植物主要在根系吸取養料并進行物質交換，所以根是植物能正常生長的重要條件。擬南芥EAR1(Enhancer of ABA co-receptor 1，AT5G22090)在幼苗的根、萌發的種子、花器官、葉肉細胞以及保衛細胞中都有表達，并且在各個器官中表達量差異不大[18]。而本研究中，通過熒光定量PCR技術來檢測在莖瘤芥幼苗不同組織器官中BjuEAR1-1的表達水平，發現BjuEAR1-1在莖瘤芥各個組織器官中均有表達，這與擬南芥中EAR1的表達一致，然而BjuEAR1-1在莖瘤芥各個組織器官中的表達量卻有顯著差異，BjuEAR1-1在莖瘤芥的根和莖中高表達，在膨大莖中表達量卻極低，表明BjuEAR1-1可能調控植物的生長發育，尤其是對根的發育以及瘤莖膨大的過程。

蛋白質的亞細胞定位對于研究蛋白的生物學功能具有重要作用，細胞內的蛋白質需要運送至正確的位置才能行使其生物學功能。擬南芥EAR1大部分定位于內質網上，少部分蛋白定位于細胞核內[18]。而本研究中，莖瘤芥BjuEAR1在細胞質和細胞核內均有定位，表明莖瘤芥BjuEAR1在細胞質和細胞核內行使其生物學功能。

綜上所述，本研究對BjuEAR1-1的蛋白編碼序列進行了克隆，通過分析發現，BjuEAR1-1的啟動子中含有響應激素、非生物脅迫的順式作用元件。通過基因表達分析，發現BjuEAR1-1在不同組織器官即根、莖、葉、花、種莢、膨大莖中均有表達，但在根中的表達量極高，并且BjuEAR1-1受低溫和ABA顯著誘導表達。結果表明，BjuEAR1-1在器官發育和植物逆境脅迫響應中具有一定功能，研究結果為全面了解BjuEAR1-1的生物功能奠定了基礎，為培育耐逆穩產的莖瘤芥新品種提供了理論依據。