小兒呼吸道合胞病毒肺炎風熱郁肺證脂類及氨基酸類代謝組學研究

徐超， 遲磊， 崔振澤

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是嬰幼兒時期呼吸道感染的重要病原之一[1]，輕者僅有上呼吸道癥狀，重者表現為毛細支氣管炎及肺炎，甚至可因呼吸衰竭而死亡[2]。而更值得業界關注的是，RSV感染后易發生反復喘息，與小兒支氣管哮喘的形成和反復發作的關系最為密切，在哮喘的發生發展和加重中被認為是一個重要的危險因子[3-4]。

RSV感染屬于傳統醫學中小兒外感熱病的范疇，古代醫家稱之為“風溫”“肺熱病”“肺炎喘嗽”。針對RSV感染的反應不同，中醫開展辨證施治，研究資料顯示，風熱郁肺證常作為小兒RSV肺炎起初的重要證候。如何利用現代醫學手段科學全面地闡述這一中醫證候的本質與內涵，成為亟需解決的迫切問題。中醫學認為證候是對機體在疾病發展過程中某一階段病因、病理、病機、病位的概括，具有多因素、多層次、整體性的特點[5]。而代謝組學是運用現代分析技術獲得內源性代謝產物譜以認識機體的整體功能狀態，具有時相性、動態性、整體性、系統性等特點，與中醫證候特點相吻合[6]。基于上述中醫證候與代謝組學的相通之處，應用現代微觀的代謝組學技術研究中醫宏觀證候本質已成為目前中醫研究的重要手段之一。本研究擬采用液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技術從整體角度探討小兒RSV肺炎風熱郁肺證患兒血清的內源性差異代謝特征，闡釋小兒RSV肺炎風熱郁肺證的差異代謝證候實質。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年11月至2018年4月大連市兒童醫院住院的毛細支氣管炎和(或)肺炎患兒30例，其中男17例，女13例，男女比例1.3∶1，月齡4～24個月，平均(11.37±5.82)個月。同期選取我院健康體檢兒童30例為對照組，其中男18例，女12例，男女比例1.5∶1，月齡2～24個月，平均(10.34±4.78)個月。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 參照《兒童社區獲得性肺炎管理指南(2013修訂)》中毛細支氣管炎和(或)肺炎的診斷標準[7]。

1.2.2 中醫診斷標準 參照世界中醫藥學會聯合會兒科分會制定的《小兒病毒性肺炎中醫診療指南》[8]。“肺炎喘嗽”風熱郁肺證辨證分型：發熱惡風、咳嗽、氣喘、痰黃或聞喉間痰鳴、有汗、鼻流清涕或黃涕、咽紅腫、口渴欲飲、納呆、面色紅、舌質紅、苔薄黃，指紋浮紫。

1.3 納入標準 (1)符合毛細支氣管炎和(或)肺炎的中西醫診斷標準；(2)年齡2個月至2歲；(3)病程在72 h以內；(4)經檢測鼻咽部分泌物RSV抗原和(或)檢測血清RSV-IgM陽性者；(5)患兒家屬簽署知情同意書。

1.4 排除標準 重癥肺炎及其他呼吸系統疾病。

1.5 檢測方法

1.5.1 試劑與儀器 乙腈(Merck,Germany)；甲酸(Sigma-Aldrich,USA)；超純水由MilliQ系統制備(Millipore，USA)；ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱、Waters ACQUITY超高效液相色譜系統(Waters，USA)；AB triple TOFTM 5600質譜(Applied Biosystems，USA)。

1.5.2 樣品采集及處理 留取門診體檢健康兒童及入院24 h內患兒空腹血清，約2 mL，保存于-80 ℃冰箱內，避免反復凍融。測定前，室溫解凍血清，8 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，加入400 μL純水，渦旋1 min，8 000 r/min再次離心10 min，取上清液即可。

1.5.3 LC-MS代謝組學分析 (1)液相條件：色譜分離系統采用Waters ACQUITY超高效液相色譜。采用ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫60 ℃，進樣量5 μL。流動相A相和B相分別為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈。洗脫梯度：5%B保持0.5 min，2 min時線性升至60%B，8 min時線性升至100%B，保持2 min，0.1 min內回到初始比例5%B以平衡色譜柱，總分析時長12 min。流動相流速為0.4 mL/min。

(2)質譜條件：使用AB triple TOFTM 5600質譜(Applied Biosystems,USA)作為檢測系統。霧化氣流流速55 psi，輔助加熱氣流流速55 psi；氣簾氣流速35 psi；質譜掃描范圍為m/z80～1 000，碰撞電壓10 V；信息依賴型采集(IDA)模式掃描范圍為m/z60～1 000，碰撞電壓40 V。正離子噴霧電壓范圍5.5 kV，離子源溫度550 ℃；負離子噴霧電壓范圍4.5 kV，離子源溫度450 ℃。

1.6 統計學方法 采用Marker View 1.2.1.1軟件(Applied Biosystems,USA)提取離子原始峰表。導出的峰表經過濾，用總峰面積進行標準化歸一處理，通過已知代謝物數據庫對代謝物進行定性。采用SIMCA-P 11.0軟件(Umetrics)進行多元統計分析，建立主成分分析(principle component analysis，PCA)及正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)數學模型，并對相應主成分的變量重要性(variable importance in the project，VIP)進行計算，選取VIP值>2的變量，采用SPSS 17.0軟件對其進行非參數檢驗，同時滿足VIP值>2且P<0.05的物質為最終的差異性代謝物。

2 結果

2.1 RSV肺炎風熱郁肺證患兒樣本代謝輪廓分析及模式識別 采用SIMCA-P軟件首先對樣本數據建立非監督的PCA分析，得分圖如圖1，圖中橫坐標和縱坐標分別代表主成分中的第一個和第二個主成分，得分圖反應了各個樣本在兩個主成分組成的坐標體系中的分布情況，模型參數R2X=0.722，Q2=0.36，模型分析了72.2%的原始數據，由圖1可見，兩組之間存在一定的交叉重疊，分離不明顯。

圖1 正常兒童與RSV肺炎風熱郁肺證患兒的PCA得分圖(黑色代表RSV肺炎風熱郁肺證患兒，灰色代表正常兒童)

進一步建立OPLS-DA模型，如圖2所示，兩組樣本分別集中分布在中線的兩側，分離趨勢明顯，說明兩組在代謝產物方面具有一定的差異。響應置換檢驗(permutation test)參數：R2Y=0.86，Q2=0.649，以上數據說明數學模型可靠穩定。

2.2 RSV肺炎風熱郁肺證患兒差異代謝產物分析結果 基于有效OPLS-DA模型下篩選出有差異代謝產物，獲得S-Plot示意圖(圖3)，圖3顯示了代謝產物的分布情況，偏離中心越遠的產物，表明該變量對模型的貢獻越大，成為差異性代謝產物的可能性也就越大。其次，計算OPLS-DA模型中的變量VIP值(圖4)提取VIP值>2的變量，并進行t檢驗(表1)，共篩選出5個RSV肺炎風熱郁肺證的差異代謝物(P<0.05)，兩組的差異代謝物相對含量見圖5。分別為：苯丙氨酸(phenylalanine，Phe);色氨酸(tryptophan，Try);磷脂酰膽堿(34∶3)(phosphatidylcholine 34∶3，PC 34∶3)；2個鞘磷脂(sphingomyelin,SM)，包括SM36∶1，SM34∶0。

圖2 正常兒童與RSV肺炎風熱郁肺證患兒的OPLS-DA得分圖(黑色代表RSV肺炎風熱郁肺證患兒，灰色代表正常兒童)

圖3 基于OPLS-DA分析的S-PLOT圖

圖4 基于OPLS-DA分析的VIP圖

圖5 兩組兒童差異代謝產物的相對含量(黑色代表RSV肺炎風熱郁肺證患兒，灰色代表正常兒童)

表1 兩組兒童差異代謝產物的VIP值、t值及變化趨勢

3 討論

謝玉瓊的《麻科活人全書》對“肺炎喘嗽”進行首次描述：“氣促之證，多緣肺熱不清所致……如肺炎喘嗽。”其中“肺”指病位，“炎”指病性即肺臟熱盛，“喘”和“嗽”則指臨床癥狀和體征。《素問·通評虛實論》曰：“乳子中風熱，喘鳴肩息者……”，一方面描述出嬰兒喘鳴癥狀與病毒性感染所引起的吸氣性三凹征等喘憋性肺炎極為相似；另一方面引出病因即風熱，推測小兒肺炎喘嗽多為熱證。“病溫者，始于上焦”的描述，揭示出在嬰幼兒時期的肺臟是較易患相關感染性疾病的。肺為華蓋，又屬嬌臟，易最先受邪，加之小兒“肺常不足”，素體“陽常有余”，故肺部受邪后導致肺氣不宣，淸肅不行，出現發熱、咳嗽、喘促等癥狀，且外感易于熱或外感寒邪速入里化熱，則易發為風熱郁肺證。

筆者基于LC-MS技術的代謝組學平臺分析范圍廣、靈敏性高，可全面地表征RSV肺炎風熱郁肺證患兒血清代謝組的特異性變化，為進一步探討小兒RSV肺炎風熱郁肺證的發病機制及與哮喘的相關性提供參考依據。本研究采用LC-MS技術檢測風熱郁肺證肺炎與正常兒童的血清代謝物后發現，風熱郁肺證肺炎與正常兒童的代謝譜存在顯著差異，部分差異代謝物結構已經確認，主要有脂類物質(PC 34∶3、SM36∶1、SM34∶0)和氨基酸類(Phe-Phe、Tryptophan)，其中磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC 34∶3)和苯丙氨酸(Phe-Phe)明顯低于正常兒童，鞘磷脂(SM36∶1、SM34∶0)和色氨酸(Tryptophan)明顯高于正常兒童，均有統計學意義。

從上述結果可見，風熱郁肺證RSV肺炎患兒血清異常代謝物的脂類物質主要是甘油磷脂代謝途徑的磷脂酰膽堿和鞘脂代謝途徑的鞘磷脂，與文獻報道一致，即脂肪酸的代謝直接或間接與熱證相關聯[9]。磷脂酰膽堿是肺泡表面活性物質(pulmonary surfactant，PS)的最主要成分，而PS又具有先天免疫功能，有助于肺部感染的預防和炎癥控制[10]，而RSV感染所引起的炎癥和免疫反應亦與PS的變化有關[11]，表面活性磷脂促進病毒進入宿主細胞，同時又具有抗病毒感染作用，可通過阻礙病毒配體與細胞表面受體結合以破壞細胞膜間的作用[12]。由此可以表明RSV肺炎易感原因之一，即機體的甘油磷脂代謝紊亂，磷脂酰膽堿含量降低，進而導致機體免疫功能減弱，抗病毒能力降低，從而易感。本實驗結果顯示RSV肺炎風熱郁肺證患兒血清中鞘磷脂(SM36∶1、SM34∶0)含量呈上升趨勢，這一現象表明RSV肺炎風熱郁肺證患兒鞘脂代謝也受到了擾亂。首先，鞘磷脂類及其代謝產物參與了多種信號傳導通路，在諸多病理過程中發揮重要作用，部分化合物的異常會導致一系列的效應，引起過敏和炎癥[13]。其次，富含鞘磷脂的特殊膜結構脂筏是多種病毒復制過程中的重要因素，如病毒入胞、胞內定向轉運、轉運病毒蛋白等[14]，RSV感染時脂筏主要與病毒顆粒的釋放有關[15]。由此揭示了RSV肺炎機體鞘磷脂代謝與RSV復制及病毒顆粒釋放有關，可能呈現正相關的趨勢。

本實驗結果顯示，RSV肺炎風熱郁肺證患兒機體不僅存在脂類代謝異常，氨基酸代謝也出現了異常的紊亂，即苯丙氨酸含量降低、色氨酸含量升高。氨基酸在許多物質代謝通路中起重要作用，它們不僅是重要的酶底物，也是重要的調節物，蘊含著重要的反映機體代謝和功能狀態的生物化學信息[16]。任何一種氨基酸的缺失都會影響免疫系統和其他器官功能的正常發揮[17]。研究表明，苯丙氨酸在體內氧化生成酪氨酸，酪氨酸經轉氨基作用最終代謝成延胡索酸和乙酰乙酸，兩者均是含有苯環。且苯丙氨酸是一種必需氨基酸，這些含苯基的化合物主要經由腸道內的菌群代謝產生，即苯丙氨酸的代謝與腸道菌群代謝具有一定的相關性[18]。前期基礎實驗也表明，RSV感染會影響大鼠機體內的菌群代謝[19]。綜上筆者推測，RSV感染是由于干擾了腸道的正常菌群代謝，使苯丙氨酸生成減少。色氨酸也是人體的必需氨基酸之一，在代謝網絡調控中起重要作用，研究表明，色氨酸代謝主要發生于炎癥組織中[20]，被吲哚胺2,3-雙加氧酶誘導的色氨酸降解是有效的抗病毒途徑[21]。本研究結果顯示，RSV肺炎風熱郁肺證患兒血清中色氨酸含量升高，提示病程初期RSV病毒的復制增多與色氨酸含量高，沒被降解有關。另一方面色氨酸代謝還具有免疫調節作用，是T細胞活化增殖過程中合成蛋白質所必需的氨基酸，即氨基酸的增多可促進T細胞的活化，誘導免疫級聯反應，從而加重炎癥反應[22]，進一步揭示了RSV肺炎病情嚴重可能與色氨酸升高有關。

綜上所述，本實驗基于GC-MS技術對RSV肺炎風熱郁肺證患兒的血清進行研究，利用OPLS-DA的方法探討血清內源性代謝物的模式變化規律，發現了與RSV肺炎風熱郁肺證密切相關的多種代謝物。但也存在一定的局限性，本研究僅觀察了發現集，發現RSV肺炎風熱郁肺證患兒的血清中磷脂酰膽堿、鞘磷脂、苯丙氨酸、色氨酸發生了明顯的變化。下一步研究考慮對驗證集的觀察，以驗證RSV肺炎風熱郁肺證的代謝標志物，為中醫證候的客觀性提供了實驗依據。