2125 例高齡孕婦無創DNA 產前檢測結果分析

寧昊豐，柴玉瓊，王亞男

（洛陽市婦幼保健院，河南 洛陽471000）

高齡孕婦是指分娩年齡大于或等于35 周歲的孕婦群體。 出生缺陷兒及染色體異常兒的發生率明顯增高是高齡妊娠的突出問題之一[1]。 為提高出生人口質量，2001 年我國母嬰保健法實施辦法及2002 年產前診斷技術管理辦法明確規定對高齡孕婦進行產前診斷[2]。 然而目前常用的產前診斷方法如絨毛膜吸取術、羊膜腔穿刺術、臍帶血穿刺術等，均屬于侵入性操作，盡管其準確率為98%~99%，但術后流產、羊水滲漏、宮內感染等并發癥的風險達0.5%~1.0%[3]，實際工作中真正愿意主動進行侵入性產前診斷的高齡孕婦只是極少數。 近年來國際上也不斷建議修正對高齡孕婦直接進行侵入性產前診斷的決定[4-5]。

隨著DNA 測序技術的迅猛發展，通過分析母親外周血中的游離胎兒DNA （cell-free fetal DNA,cffDNA） 為胎兒的染色體疾病篩查與診斷提供了一個全新的策略[6]。目前孕婦外周血胎兒游離DNA無創產前檢測 （Non-invasive prenatal testing,NIPT） 對染色體非整倍體的檢出率可達99.2%，假陽性率為0.09%[7]。 憑借著在無創和準確方面的優越性，此技術在臨床上已得到廣泛應用[8-9]。

本研究通過回顧分析2015 年1 月至2018 年6 月在本院采血進行無創DNA 檢測的2125 例高齡孕婦產前檢測結果，比較無創DNA 與有創性產前診斷結果的符合率， 并通過電話隨訪統計妊娠結局，探討無創DNA 技術在高齡孕婦中的臨床應用價值及局限性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015 年1 月至2018 年6 月在本院接受無創DNA 檢測的2 125 例高齡孕婦作為觀察對象，均為漢族、自然受孕、單胎妊娠，孕周為12~22 周，平均孕周（17±1.2）周，年齡范圍35~47 歲，平均年齡（38.5±2.7）歲。

1.2 研究方法 抽取孕婦外周血10 mL， 送至北京貝瑞和康生物科技有限公司和家輝遺傳專科醫院聯合開展的檢測中心進行檢測。 通過提取血漿游離DNA，經過末端修復，接頭連接，構建文庫，PCR擴增，富集后得到測序文庫，質控合格后采用Next SeqCN500 高通量測序平臺檢測，并通過生物信息學分析計算Z 值。 平均每個樣本獲得的測序數據量約為3.5 M reads，唯一比對reads 數為1.8 M，單端測序讀長為36 bp，基因組覆蓋度為0.1×。若-3

2 結果

2.1 無創DNA 檢測結果 2125 例高齡孕婦中，共檢測出高風險29 例：其中21-三體10 例；18-三體4 例；13-三體2 例；性染色體異常11 例，分別為5例45，XO ，3 例47，XYY，3 例47，XXX；CNV 異常2 例，分別為del(22)(q11.2)和dup(3)(p26.3)。 陽性率為1.36%（29/2125）。 見表1。

表1 無創DNA 高風險病例的侵入性產前診斷結果

2.2 無創DNA 結果異常者行侵入性產前診斷結果 對29 例高風險孕婦進行侵入性產前診斷：行羊水穿刺手術，并進行羊水細胞培養。 通過染色體G 顯帶核型分析與SNP Array 基因芯片檢測，最終共25 例侵入性產前診斷結果與無創DNA 提示的高風險結果一致， 分別為10 例21-三體，4 例18-三體，1 例13-三體，3 例45，XO，3 例47，XYY，3例47，XXX，1 例del(22)(q11.2)。其余4 例未發現染色體數目或結構異常。

無創DNA 的總體陽性預測值為86.21%（25/29）， 其中對于21-三體、18-三體以及性染色體數目增加（XXX/XXY）的陽性預測值均達100%（20/20）。 而對于13-三體、45，XO 以及CNV 的檢測結果則出現了假陽性的情況， 陽性預測值分別為50%、60%、50%。 見表1、表3。

2.3 無創DNA 結果低風險者追蹤回訪結果 對2 096 例低風險孕婦進行電話回訪，13 例失訪，共得到有效回訪數據2 083 例。 其中有1 例在孕24周的超聲檢測中發現胎兒骨骼結構異常， 經羊水穿刺后，通過染色體核型分析與基因芯片檢測，確診為arr[hg19]4q31.22(146844421-147304884)×3，dup 0.8 Mb。 經查閱相關文獻，盡管該區段無明確致病相關報道，但是該區段包含可導致脊柱側凸、骨骼發育不良的致病基因SLC10A7[10-11]。 通過與胎兒父母基因組比對，發現該CNV 屬于新發變異，最終判定為可疑致病，經遺傳咨詢，決定進行引產手術。 另有2 例在孕28 周之前不明原因流產。 其余2 080 例孕婦均表示出生后孩子生長發育情況良好。 去掉失訪和不明原因流產的數據后，總體陰性預測值為99.95%（2 080/2 081），見表2、表3。

表2 無創DNA 低風險病例的跟蹤隨訪結果

表3 無創DNA 的檢測效率（%）

3 討論

《中國出生缺陷防治報告（2012）》指出我國是世界上人口出生缺陷率高發的國家， 每年約有90萬出生缺陷兒誕生， 給家庭和社會帶來沉重的負擔。染色體異常是出生缺陷的主要原因。常見的活產兒染色體異常主要包括21-三體、18-三體、13-三體、性染色體非整倍體及CNV 等。 近年來，隨著社會經濟發展，晚婚晚育人口增多，國家“二胎政策”的全面開放，高齡孕婦比例逐年上升。 隨著女性年齡增加，卵巢的各項功能開始退化，卵子受到的外界理化刺激不斷積累， 生育染色體異常兒的概率也會增加。 傳統的產前診斷方式以侵入性為主，但該技術存在一定的風險性，給高齡孕婦本人和家屬帶來極大的心理壓力。 隨著測序技術不斷進步，無創DNA 在染色體非整倍體異常與全基因組拷貝數變異的檢測已成為可能， 而并且以無創性和相對較高的準確性在臨床獲得了較廣泛的應用[12-14]。

我們研究了近年來在本院進行無創DNA 篩查的2125 例高齡孕婦檢測數據，以分析無創DNA的篩查效率。 其中無創DNA 對于21-三體、18-三體以及性染色體數目增加（XXX/XXY）的檢測最為準確，陽性預測值均達到了100%。 對于13-三體、45，XO 及CNV 的檢測陽性預測值較低。 本研究中， 無創DNA 對13-三體的篩查效能低于21-三體和18-三體的結果，與國內外報道相一致[7,13]。 無創DNA 發生假陽性可能有母體染色體核型異常、孕婦患實體腫瘤、限制性胎盤嵌合等原因[15-16]。 另外該檢測與GC 含量偏向性相關， 有研究表明13號染色體的GC 含量較低，導致測序時產生偏差[17]。此外，隨著孕婦年齡的增長，其淋巴細胞的X 染色體非整倍體的頻率也會增加， 尤其是X 染色體的丟失增加，這也可能是造成假陽性的原因之一[18]。

在對無創DNA 檢測結果低風險的孕婦回訪中， 我們發現了一例通過后期B 超檢測發現異常從而進行侵入性產前診斷確診為CNV 異常的病例。 引起NIPT 假陰性的原因主要有母體外周血中的cffDNA 含量過低， 和胎兒本身染色體異常，但胎盤滋養層細胞正常等[16,19]。 另外由于測序深度和生信分析技術水平的限制，導致無創DNA 對小片段的染色體異常檢測的靈敏度偏低。 因此無創DNA 低風險的孕婦，并不能完全排除異常妊娠，特別是對于出生缺陷高發的高齡孕婦， 更要做好系統全面的產前檢查。

綜上所述，無創DNA 檢測技術憑借著在安全性、靈敏度、特異度等方面所具有的優勢使廣大孕婦獲益。對于高齡孕婦，可優先選擇進行無創DNA檢測進行篩查。 此檢測結果在一定假陽性，因此陽性結果必須通過侵入性產前診斷確診。 當檢測結果為陰性時，孕婦也一定要按照正規產檢流程，嚴格進行B 超檢查， 發現異常者仍需做侵入性產前診斷確診，避免染色體異常胎兒的出生。