頂花胡椒石油醚萃取物化學(xué)成分及抗菌活性研究

田波，徐文暉，孟偉，3

1.貴州林業(yè)勘察設(shè)計有限公司，貴州貴陽 550000；

2.西南林業(yè)大學(xué)，云南昆明 650000；

3.貴州省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，貴州貴陽 550000

頂花胡椒（Piper terminaliflorum）為胡椒科胡椒屬攀援灌木[1-3]，對胡椒屬植物化學(xué)研究表明，吡啶、哌啶和馬兜鈴內(nèi)酰胺等類生物堿，木脂素及揮發(fā)油為本屬的主要成分，此外，還發(fā)現(xiàn)多種黃酮類化合物[4-8]。國內(nèi)外對數(shù)十種胡椒屬植物的化學(xué)成分和藥理作用作了大量的研究，分離了多種化合物，并發(fā)現(xiàn)該屬植物具有抗血小板活性、抗炎活性、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用、抗感染活性、抗氧化活性、抗腫瘤作用及其他藥理活性[9-13]。胡椒屬植物及化學(xué)成分還具有降血糖、降血脂、抗疲勞、紫外線防護(hù)等多種藥理作用。

胡椒屬植物具有復(fù)雜的化學(xué)成分和廣泛的藥理作用，已有的研究結(jié)果提示胡椒屬植物在臨床上的應(yīng)用還比較局限，這和中國有豐富的胡椒屬植物資源以及該屬植物廣泛的藥理活性不相符。對胡椒屬植物的有效化學(xué)成分篩選，已取得了許多進(jìn)展，分離得到并合成了許多有效的化合物，但胡椒屬植物的化學(xué)成分的分離和藥理作用研究還遠(yuǎn)未結(jié)束，對其進(jìn)一步的研究也必將會有更多結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)、機(jī)理獨(dú)特的新型藥物被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

頂花胡椒全草于2020 年7 月采自云南臨滄，經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)植物教研室鑒定為胡椒科胡椒屬植物頂花胡椒。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇（以上均為分析純）；蒸餾水；顯色劑：10%H2SO4；200～300目正相硅膠。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

核磁共振儀、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、紫外分析儀、數(shù)顯恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高效液相色譜儀、真空抽濾機(jī)、分析天平；剪刀、一次性手套、粉碎機(jī)、布氏漏斗、抽濾瓶、分液漏斗、圓底燒瓶、常壓玻璃色譜柱、TLC 板、展開槽、三角瓶、玻璃棒、燒杯、磨口玻璃瓶、移液槍、洗耳球、玻璃毛細(xì)管、量筒、漏斗、膠頭滴管、濾紙、脫脂棉、鋁箔紙。

1.1.4 供試病原菌

供試病原真菌：西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp．niveum），大豆炭疽病菌（Colletotrichum glycines）。

供試病原細(xì)菌：番茄青枯病菌（Ralstonia solanaceance）。

1.2 頂花胡椒的分離純化

1.2.1 頂花胡椒浸膏的制備

將頂花胡椒樣品陰干，粉碎，得到頂花胡椒粉末11kg，用濃度為95%乙醇室溫浸提3 次，每次3d，過濾浸提液，將過濾后的浸提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到頂花胡椒浸膏3.5L。

1.2.2 乙酸乙酯、石油醚萃取物的提取

將3.5L 頂花胡椒的浸膏和適量蒸餾水加入分液漏斗中，然后分別加入石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將得到的萃取物減壓濃縮蒸干，最終得到石油醚萃取物303.6g，乙酸乙酯萃取物145.9g。

1.2.3 頂花胡椒石油醚萃取物的柱色譜分離

（1）拌樣：將303.6g 頂花胡椒石油醚萃取物用適量氯仿溶解后加入到290g 硅膠中，用玻璃棒攪拌，使樣品充分吸附在硅膠上；然后將其倒在大小合適的托盤上，鋪平；待溶劑完全揮發(fā)以后，將拌好的樣品置于研缽中研磨至沒有明顯的結(jié)塊。

（2）裝柱：為濕法裝柱。將色譜柱固定在鐵架臺上，與地面垂直并且與鐵架臺水平，在柱子底部放置適量的棉花，打開活塞開關(guān)，并在柱子正下方放置一個大燒杯；稱取1130g 硅膠置于潔凈干燥的燒杯中，加入適量石油醚，使硅膠充分濕潤，用玻璃棒攪拌混勻，可將燒杯用超聲儀器做超聲震動處理，幫助硅膠中氣泡的排出，然后緩慢加入色譜柱中；待硅膠完全沉淀、溶劑液面稍高于硅膠表面時，關(guān)閉活塞開關(guān)。

（3）上樣：采用干法上樣。將拌樣完成的樣品緩慢均勻的加入在上述硅膠上，加的過程中可用洗耳球輕敲柱子，使樣品能夠分布均勻且有助于氣泡的排出；然后用石油醚沖洗粘在色譜柱壁上的樣品，盡量不要破壞硅膠面的平整；打開活塞開關(guān)，使溶劑流出，在溶液表面接近樣品硅膠面時，在加入石油醚，這樣少量加入，重復(fù)2～3 次。

（4）梯度洗脫：分別用石油醚：甲醇[200∶1（4000ml）、100∶1（4550ml）、50∶1（4000ml）、20∶1（6960ml）、10∶1（6070ml）、5∶1（12495ml）、3∶1（7370ml）]進(jìn)行梯度洗脫，用按順序編號的100ml 錐形瓶接樣，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后轉(zhuǎn)移到同樣順序編號的小玻璃瓶中。

（5）薄層層析檢測：根據(jù)需要點(diǎn)樣的樣品個數(shù)取大小適宜的薄層板，在其一端約1.5cm 處用鉛筆劃線，每隔1cm 左右用鉛筆稍作記號，并寫下需要進(jìn)行點(diǎn)樣的樣品編號；選擇合適的有機(jī)溶劑將樣品溶解至適宜的濃度，用毛細(xì)管吸取樣品后點(diǎn)于薄層板上相應(yīng)的位置，點(diǎn)應(yīng)為圓點(diǎn)，直徑2mm～4mm，點(diǎn)樣時要注意勿損傷薄層表面。

點(diǎn)樣完成后，將配好的展開劑倒入展開缸內(nèi)，蓋上蓋子并搖晃展開缸，以確保展開劑充分混合。把點(diǎn)樣完成的薄層板放入展開缸內(nèi)，展開劑不能淹沒點(diǎn)樣的樣品，待展開至一定的距離（薄層板頂端需留出部分空余便于寫展開條件），取出薄層板，輕劃出展開劑擴(kuò)散的邊緣；展開劑揮發(fā)后，用紫外分析儀245nm 和365nm 波長觀察，用鉛筆劃出可見的熒光斑點(diǎn)；然后用10%H2SO4-Ethanol 將薄層板染色，再用熱風(fēng)筒烘烤至出現(xiàn)紫紅色顯色區(qū)，盡量不要把薄層板烤糊影響觀察，有時不會出現(xiàn)紫紅色顯色，可能是樣品中沒有可顯色的化合物或者濃度太淡；觀察、分析烤好的薄層板，若有單一的圓點(diǎn)，可換其他兩種展開劑再次展開，如果仍為單一圓點(diǎn)，即可初步判斷其為單體化合物，計算Rf值。

（6）合并相同餾分：將減壓濃縮后的樣品采用薄層層析檢測，把薄層板上顯色相同或相近但是明顯不是單體化合物的樣品合并，得到15 個餾分，記作Fr.A～Fr.O。再將這些餾分中的I 與J 再次合并后的餾分用硅膠柱層析法或高效液相色譜法等方法進(jìn)行分離純化，共得到3 個化合物并鑒定了其中2 個的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具體過程如圖1。

1.2.4 Fr.I 和Fr.J 的分離純化

將Fr.I 和Fr.J 合并濃縮，進(jìn)行正相硅膠柱層析分離。采用干法上樣、濕法裝柱的方法，裝柱上樣完成后，依次用石油醚：丙酮[14∶1（1558ml）、10∶1（3759ml）、7∶1（2050ml）、4∶1（3092ml）、2∶1（2031ml）]、丙酮1240ml 進(jìn)行梯度洗脫。得到8 個餾分，記作Fr.J1～Fr.J8。

經(jīng)薄層層析分析，其中Fr.J5 組分可以做MCI脫色。依次用甲醇-水70%(600ml)、80%( 600ml)、90%( 6000ml)進(jìn)行梯度洗脫。得到1 個餾分，仍記作Fr.J5。

經(jīng)薄層層析分析，再對Fr.J5 組分做C-18 反相硅膠柱層析分離。依次用濃度為50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的甲醇-水1000ml 進(jìn)行梯度洗脫。得到24 個餾分，分別記作Fr.J5A～Fr.J5X。

經(jīng)薄層層析分析，其中Fr.J5J 組分適合做高效液相色譜法分離。經(jīng)分離得到3 個化合物，記為化合物1、化合物2 和化合物3，即圖3 中Fr J5J1、Fr J5J2 和Fr J5J3。

1.3 頂花胡椒抗菌活性研究

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

將不同劑量的抗菌藥物，分別加于融化并冷至45℃的定量瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，傾注成無菌平板，即為含有藥物濃度遞減的培養(yǎng)基；接種測試菌于該培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后觀察被檢菌生長情況，最低藥物抑制細(xì)菌生長者，即最小抑菌濃度(MIC)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

該實(shí)驗(yàn)采用瓊脂稀釋法，以M-H 瓊脂作為實(shí)驗(yàn)瓊脂培養(yǎng)基，陰性對照為DMSO，將待測目標(biāo)物溶于DMSO，將試驗(yàn)待測的化合物分別稀釋至如下濃度：32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，分別接種試驗(yàn)菌種于37℃培養(yǎng)24h。測試其抗菌活性，以抑制微生物生長的最低藥物濃度為MIC，以目標(biāo)化合物抑制所選菌種80%生長率的濃度作為判斷終點(diǎn)，并[14]參照Xing congli[14]等人的抗菌測定方法進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分鑒定

該實(shí)驗(yàn)首先用乙醇對頂花胡椒粉末進(jìn)行浸提，將浸提液減壓濃縮得到浸膏；再分別用乙酸乙酯、石油醚進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯及石油醚萃取物；利用各種類型、規(guī)格的硅膠柱層析以及高效液相色譜法對石油醚萃取物進(jìn)行分離純化，最終分離了3 個化合物并鑒定了其中2 個的化學(xué)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用1H-NMR、13C-NMR 等核磁共振譜，高分辨質(zhì)譜（HRMS）等現(xiàn)代結(jié)構(gòu)解析方法，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)鑒定出了這2個化合物的結(jié)構(gòu)?；衔锝Y(jié)構(gòu)解析如下，結(jié)果見表1和表2。

表1 化合物1 的13C-NMR 和1H-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 13C-NMR and 1H-NMR Data of Compound 1

表2 化合物2 的13C-NMR 和1H-NMR 數(shù)據(jù)Tab.2 13C-NMR and 1H-NMR Data of Compound 2

化合物1：白色粉末（6.3mg），易溶于氯仿。應(yīng)用1H-NMR、13C-NMR 推測其分子式為C20H21O7，分子量373。將其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對照，鑒定為5-methoxysesa-min，屬于木脂素類，結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖2 化合物1 的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of Compound 1

化合物2：黃色固體（12.6mg），可溶于氯仿。應(yīng)用1H-NMR、13C-NMR、MS 推測其分子式為C19H27NO4，分子量333。將其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對照，鑒定為Pipercallosidine，屬于酰胺生物堿類，結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3 化合物2 的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of Compound 2

2.2 抗菌活性測定

對分離得到的化合物1 和化合物2 進(jìn)行了抗菌活性評價，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 頂花胡椒中2 個化合物的抗菌活性Tab.3 Anti-microbial Activities of 2 Compounds from Piper terminaliflorum

從表3 中可以看出：化合物1 對抗病原真菌（西瓜枯萎病菌、大豆炭疽病菌）和抗病原細(xì)菌（番茄青枯病菌）均有著不同程度的抑制作用，其最小抑菌濃度分別是12.6ug/mL、17.1ug/mL、11.7ug/mL；化合物2 對抗病原真菌（西瓜枯萎病菌、大豆炭疽病菌）和抗病原細(xì)菌（番茄青枯病菌）也有著不同程度的抑制作用，其最小抑菌濃度分別是12.4ug/mL、8.7 ug/mL、10.4ug/mL。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)提取出了頂花胡椒石油醚層的化學(xué)成分，最終分離純化了3 個化合物并鑒定了其中2 個的結(jié)構(gòu)式，確為單體化合物。分別為：化合物1，白色粉末，5-methoxysesamin（木脂素類），易溶于氯仿，質(zhì)量6.3mg；化合物2，黃色固體，Pipercallosidine（酰胺生物堿），可溶于氯仿，質(zhì)量12.6mg?？咕钚詼y試結(jié)果表明：2 個化合物均對抗病原真菌（西瓜枯萎病菌、大豆炭疽病菌）和抗病原細(xì)菌（番茄青枯病菌）均有著不同程度的抑制作用。

3.2 討論

目前僅對胡椒屬中少數(shù)植物進(jìn)行了深入研究，該屬植物的化學(xué)成分和生物活性研究還有很大的空間。此次試驗(yàn)分離純化得到并鑒定的2 個單體化合物均具有不同程度的抗真菌或抗細(xì)菌的作用，可見在研究具有抗菌作用的藥物這一方面，頂花胡椒具有很高的利用價值以及研究前景，有望在今后對該植物的研究中得到更多新的具有抗菌作用的活性成分并將其制成新的藥物。