黃蜀葵花總黃酮通過激活AMPK/mTOR通路調控自噬改善克羅恩病腸道纖維化

張慧翔，張丹，錢海華，王雅麗，曾莉?

（1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫院，江蘇 南京 210023）

克羅恩病（Crohn's disease，CD）是一種慢性、反復性的炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD），其臨床癥狀包括腹痛、腹瀉、發熱、疲勞和體質量減輕［1］。腸道纖維化是CD 的常見并發癥之一。由于CD 的透壁性炎癥，纖維化可能涉及腸壁的所有層次，導致腸道的增厚和狹窄［2］，甚至造成腸梗阻。歐洲的一項隊列研究顯示，在被確診為CD 的5年內，14%的患者出現狹窄或穿透性并發癥［3］。研究表明，狹窄性CD 對常用于治療CD 的TNF 抑制療法沒有明顯反應［4］。當前腸道狹窄的主要治療方式為球囊擴張、狹窄成形術和手術切除，但大多數CD 患者會在術后出現臨床復發，需要進一步治療，其中大約20%的患者需要再次手術［5］。因此，有必要研發治療CD腸道纖維化的有效藥物。

自噬是一種細胞內代謝機制，細胞質中的物質通過自噬體被送到溶酶體中被降解［6］。通過該過程，自噬在人體中發揮著保護細胞、保護組織和抗炎的作用［7］，對炎癥性疾病和自身免疫性疾病具有重要意義。據報道，CD的病因主要涉及基因易感性、家族史、環境因素、腸道免疫系統失調和微生物群紊亂［1］。而自噬有關基因，包括IRGM、NOD2和ATG16L1等均與CD 密切相連［7-8］。綜上，自噬可能與CD 的發病有著內在聯系。此外，研究表明自噬是多器官纖維化疾病的一個重要調節器［9］，從自噬角度出發可能會為治療CD 腸道纖維化提供新的治療機制。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP－activated proteinkinase，AMPK）是一種穩健的能量狀態傳感器，由AMP與ATP狀態調節，啟動能量平衡機制［10］。mTOR復合物1（mTOR complex 1，mTORC1）是雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）與伴生蛋白結合產生的差異信號綜合體，可根據營養環境調節細胞的生長和代謝［11］。AMPK/mTOR 通路是自噬上游的一條關鍵通路。在營養豐富時，mTORC1磷酸化ULK1，阻斷其被AMPK 激活，達到抑制自噬啟動的目的［12］。當處于營養不足時，AMPK 通過磷酸化和激活TSC2以及磷酸化并抑制Raptor（mTOR的調節相關蛋白）降低mTORC1的活性，同時磷酸化并激活ULK1，引發自噬級聯的啟動［10］。故本研究選用AMPK/mTOR 通路作為深入探討自噬與CD腸道纖維化內在關聯的指標。

黃蜀葵花總黃酮（total flavone ofAbelmoschus manihot，TFA）是錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵花的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、免疫調節等作用［13］。研究報道，TFA 可以通過調節上皮間質轉變來緩解TGF－β 誘導的CD 腸道纖維化［14］，并減少腸道纖維化小鼠模型中的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積［15］。然而，其中的機制仍需進一步研究。

因此，本研究通過分離大鼠原代細胞，從細胞自噬的角度，探討TFA 對腸道成纖維細胞的作用及分子機制，為防治CD腸道纖維化提供基礎理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物

選擇健康SPF 級SD 雄性大鼠20 只，體質量180～200 g，購自杭州醫學院，動物許可證號：SCXK（浙）2019－0002。飼養條件：分籠飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物房，溫度為23～25 ℃，相對濕度為50%～60%，每日光照12 h，大鼠被允許自由飲水與采食。所有實驗研究均依照南京中醫藥大學附屬醫院實驗動物研究倫理規范和許可進行（倫理號：2020DW－30－01）。

1.2 藥物與試劑

TFA 由南京中醫藥大學附屬醫院制劑部提供；雷帕霉素（rapamycin，RAPA）（上海MCE 公司，貨號：HY－10219）；胰島素樣生長因子－1（insulin－like growth factor－1，IGF－1）（美國Abcam 公司，貨號：ab198570）；AMPK 抑制劑化合物C（Compound C，CC）（selleck 公司，貨號：S7306）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（美 國Gibco 公 司，貨 號：10010023）；CCK－8試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，貨號：C0038）；逆轉錄試劑盒、SYBR 試劑盒（上海翌圣生物科技公司，貨號：11201ES03、11123ES60）。

Collagen Ⅰ、β－actin、LC3 Ⅱ、Beclin－1、p62、Vimentin、α－SMA、AMPK、mTOR、p－mTOR 抗體（美國Proteintech 公司，貨號：14695－1－AP、66009－1－Ig、14600－1－AP、11306－1－AP、18420－1－AP、10366－1－AP、14395－1－AP、10929－2－AP、66888－1－Ig、67778－1－Ig）；ATG16L1、p－AMPK、4EBP1、p－4EBP1、p70S6K、p－p70S6K 抗體（美國Abcam 公司，貨號：ab188642、ab133448、ab32024、ab278686、ab32529、ab59208）；進口血清Opti－MEM（美國Gibco 公司，貨號：31985062）；mRFP－GFP－LC3 質粒（上海GeneTalk公司，貨號GT－AP－V103）；Collagen Ⅰ、β－actin 引物序列均由通用生物公司設計。

1.3 儀器

細胞培養箱（上海SANYO），倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司），臺式低速離心機（北京大龍興創實驗儀器有限公司），凝膠成像分析儀（上海勤翔），共聚焦顯微鏡（美國NIKON 公司），PCR 儀（德國Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 提取大鼠原代腸道成纖維細胞

根據參考文獻［16-17］中的步驟，進行大鼠原代腸道成纖維細胞提取。將細胞培養于37 ℃，5%CO2培養箱中，并根據細胞生長狀況更換培養基。

2.2 免疫熒光法鑒定原代腸道成纖維細胞

取IFs 細胞接種于6 孔板中，固定后，用PBS 清洗3次。0.1%Triton X－100透化，PBS清洗。5%BSA 液封閉20 min。加入Vimentin、α－SMA 抗體在4 ℃下孵育過夜。PBS 清洗后，加入二抗孵育1 h，清洗后滴加DAPI，封片觀察。

2.3 CCK－8法測定TFA和RAPA的最佳濃度及時間

將含有5 × 103個細胞的100 μL 細胞懸液置于96 孔板中。培養過夜后，用無血清培養基或含RAPA（1、5、10 nmol/mL）、含TFA（5、10、25、50、75、100、150、200 μg/mL）的無血清培養基培養細胞24、48、72 h。培養結束后利用CCK－8 試劑盒檢測細胞生長狀況，在450 nm波長下進行讀數。

2.4 分組與干預

2.4.1 TFA 對IFs 細胞合成Ⅰ型膠原蛋白及自噬的影響

根據CCK－8的結果，選擇濃度為5、10、50 μg/mL 的TFA 作為TFA 的工作濃度。將IFs 細胞隨機分為對照組、模型組和TFA 低、中、高劑量組。對照組不做任何處理；模型組用100 ng/mL 的IGF－1 干預24 h；TFA 低、中、高劑量組用100 ng/mL 的IGF－1 干預24 h 后，再用5、10、50 μg/mL 的TFA 處理48 h。

2.4.2 TFA 與IFs 細胞中自噬相關通路AMPK/mTOR的關系

根據CCK－8 的結果，選擇濃度為5 nmol/mL 的RAPA 作為RAPA 的工作濃度。將IFs 細胞分為對照組、模型組、TFA組、TFA+CC組和TFA+RAPA組。對照組不做任何處理；模型組用100 ng/mL 的IGF－1 干預24 h；TFA 組用100 ng/mL 的IGF－1 干預24 h 后，再用10 μg/mL的TFA處理48 h；TFA+CC組用100 ng/mL的IGF－1 干預24 h 后，再 用10 μg/mL 的TFA 聯 合10 μmol/mL的CC處理48 h；TFA+RAPA組用100 ng/mL的IGF－1 干 預24 h 后，再 用10 μg/mL 的TFA 聯 合5 nmol/mL的RAPA處理48 h。

2.5 Western blot

使用RIPA 裂解液提取總蛋白，測定、統一蛋白質濃度后煮沸變性。運用SDS－PAGE膠進行蛋白電泳，轉膜封閉，加入稀釋后的一抗，4 ℃下過夜孵育。PBST洗滌3 次后，加入相應二抗室溫下孵育1.5 h。清洗后借助凝膠成像分析儀曝光顯影，Image J 軟件分析灰度值，β－actin為內參蛋白。

2.6 免疫熒光

除抗體外，其余步驟同“2.2”項下的處理方法。

2.7 qRT－PCR

Trizol 試劑提取細胞總RNA，測定RNA 濃度和純度后定量，逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA，根據SYBR 試劑盒設定PCR 擴增反應體系，上機檢測。采用2－ΔΔCT法計算mRNA 相對表達量。β－actin 為內參。引物序列見表1。

表1 qRT－PCR 引物序列

2.8 mRFP－GFP－LC3實驗檢測IFs細胞自噬流

轉染步驟參考Lipofectamine 2000 說明書進行。將含有mRFP－GFP－LC3 質粒和Lipofectamine 2000的空白DMEM 滴入6孔板，培養IFs細胞8 h。然后，用完全培養基培養24 h 后，用PBS 清洗IFs 細胞，采用共聚焦顯微鏡檢測。

2.9 統計學方法

實驗數據用Graph Pad Prism 8.0.2 統計軟件進行分析。數據以均數± 標準差表示（n= 3）。多組間的差異采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 原代腸道成纖維細胞的鑒定

根據免疫熒光結果所示，細胞表達Vimentin（綠色熒光），不表達α－SMA（無明顯熒光），細胞核呈藍色熒光，且95%以上的細胞均呈現該特征，證明提取的細胞為腸道成纖維細胞。見圖1。

圖1 免疫熒光鑒定細胞特征圖

3.2 TFA和RAPA的最佳工作濃度及干預時間

本研究選擇濃度為5、10、50 μg/mL 的TFA 和濃度為5 nmol/mL 的RAPA 作為工作濃度進行后續的實驗，干預48 h，對腸道成纖維細胞存活率影響見圖2和圖3。

圖2 TFA對IFs細胞存活率的影響

圖3 RAPA對IFs細胞存活率的影響

3.3 對IGF－1誘導的IFs細胞Collagen Ⅰ的影響

與對照組相比，模型組Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平顯著上升（P＜0.01）。與模型組相比，TFA低、中、高劑量組中的Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平明顯下調（P＜0.01），其中Collagen Ⅰ的表達與TFA濃度呈負相關，表明TFA 具有抑制IFs 細胞合成Ⅰ型膠原蛋白的作用。見圖4。

圖4 TFA對IFs細胞Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）合成的影響

3.4 TFA對IGF－1誘導的IFs細胞自噬的影響

免疫熒光結果顯示，與對照組相比，模型組中LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1 蛋白的表達減弱，p62 蛋白表達增強；與模型組相比，TFA 低中高劑量組中LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1 蛋白表達水平增強，p62蛋白表達下降。見圖5。mRFP－GFP－LC3 結果顯示，與對照組相比，模型組中細胞紅色熒光信號減弱，黃色熒光信號降低，表明自噬流減少；與模型組相比，TFA 低、中、高劑量組中紅色和黃色熒光信號均增強，自噬流增多，并且與TFA 濃度呈正相關。見圖6。mRFP－GFP－LC3 實驗和免疫熒光結果表明，TFA 能夠促進IFs 細胞自噬。

圖5 免疫熒光檢測TFA對IFs細胞中自噬相關蛋白的影響

圖6 mRFP－GFP－LC3檢測TFA對IFs細胞中自噬流的影響

3.5 AMPK/mTOR 通路對TFA 干預的IFs 細胞模型合成Ⅰ型膠原蛋白的影響

AMPK/mTOR通路是自噬的一個關鍵通路，本研究采用了AMPK抑制劑化合物C（CC）、mTOR抑制劑雷帕霉素（RAPA）與TFA聯合使用干預IGF－1誘導的IFs細胞。結果與TFA 組相比，TFA+CC 組Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平明顯上升（P＜0.01），TFA + RAPA組中Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平下降（P＜0.01），表明AMPK/mTOR通路對TFA抑制IGF－1誘導的IFs細胞合成Ⅰ型膠原蛋白有調控作用。見圖7。

圖7 AMPK/mTOR通路對TFA調節IFs細胞合成Ⅰ型膠原的影響

3.6 AMPK/mTOR 通路對TFA 干預的IFs 細胞模型自噬的影響

與TFA 組相比，TFA + CC 組的趨勢則相反，免疫熒光結果顯示，LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1 蛋白水平減弱，p62 蛋白水平升高；TFA + RAPA 組中免疫熒光結果顯示，LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1 蛋白熒光表達上升，p62 蛋白熒光表達下降。 見圖8。mRFP－GFP－LC3 結果顯示，TFA+CC 組細胞中紅色及黃色熒光信號皆相對減少，自噬流下降；TFA+RAPA 組細胞中紅色熒光信號與黃色熒光信號均上升，自噬流增加。見圖9。表明AMPK/mTOR 通路對TFA 干預的IFs 細胞模型中的自噬具有調控作用。

圖8 AMPK/mTOR通路對TFA干預的IFs細胞模型中自噬相關蛋白的影響

圖9 AMPK/mTOR通路對TFA干預的IFs細胞模型中自噬流的影響

3.7 TFA 對IGF－1 誘導的IFs 細胞中AMPK/mTOR通路的影響。

與對照組相比，模型組中p－AMPK/AMPK 比值減少，p－mTOR/ mTOR、p－p70S6K/p70S6K 和p－4EBP1/4EBP1 比值增多（P＜0.01）。與模型組相比，TFA 組中p－AMPK/AMPK 比值上升 ，p－mTOR/mTOR、p－p70S6K/ p70S6K 和p－4EBP1/4EBP1 比值減弱（P＜0.01）。與TFA 組相比，TFA+CC 組下調了p－AMPK/AMPK 比值，上調了p－mTOR/mTOR、p－p70S6K/p70S6K 和p－4EBP1/4EBP1 的比值；TFA + RAPA 組則相反（P＜0.01）。說明TFA 可能對IGF－1 誘導的IFs細胞中AMPK/mTOR通路具有激活作用。見圖10。

圖10 TFA對IGF－1誘導的IFs細胞AMPK/mTOR通路的影響

4 討論

腸道纖維化作為CD最具危險性的并發癥之一，可能致使腸道狹窄和梗阻，給患者帶來極大的健康和經濟負擔［18］。當前研究認為CD的慢性炎癥刺激腸道中ECM的過度沉積和肌肉增厚，造成腸道纖維化的發生［2］。ECM中膠原蛋白的沉積和交聯致使的腸道僵硬則促進了纖維化的進程［19］。據報道，CD 患者的腸道組織中成纖維細胞增殖更快［20］。Ⅰ型膠原蛋白是腸道成纖維細胞分泌的主要膠原蛋白（約80%），其作為ECM 的組成部分，進一步推動纖維化的發展［21］。因此，抑制腸道成纖維細胞合成Ⅰ型膠原蛋白是改善ECM、控制和預防腸道纖維化的一個重要方向。故本研究采用具有促進膠原蛋白產生和增殖作用的生長因子IGF－1［22］干預IFs細胞建立細胞模型，實驗結果顯示，經過IGF－1處理后的IFs 細胞Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平均明顯上升，表明細胞模型建立成功。當TFA 干預IGF－1誘導的IFs 細胞時，Collagen Ⅰ蛋白及mRNA 表達下降。說明TFA可以抑制IFs細胞中Ⅰ型膠原蛋白的合成。

自噬及其相關通路具有平衡炎癥和免疫的作用［23］。CD 作為炎癥性腸病的一種，與潰瘍性結腸炎相比，更容易受遺傳因素的影響［24］。而研究發現，CD 易感患者的自噬相關基因如ATG16L1、IRGM、LRRK2 和NOD2/CARD15 等表達失調，說明自噬在CD 病理過程中可能發揮著關鍵作用［25］。MaciasCeja 等［26］發現，用自噬激活劑RAPA 治療TNBS 誘導的小鼠模型可以降低促炎因子（TNF－α、COX－2、IL－1β、誘導型NOS和IL－6）水平，并增加抗炎因子IL－10 的表達。另一方面，自噬與ECM 也存在著復雜的關系［27］。研究發現［28］，在腸道纖維化模型小鼠中，自噬減弱，在刺激自噬后，腸道纖維化減輕，成纖維細胞的膠原蛋白降解增多，而抑制自噬則加劇纖維化，改變炎癥反應，減弱膠原蛋白降解。表明自噬刺激可能是治療腸道纖維化的一個重要機制。在本研究中，TFA可以上調IFs細胞中自噬標志蛋白LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1的表達，降低自噬底物蛋白p62的水平，增加自噬流，表明TFA 具有激活IFs細胞自噬的作用。

AMPK/mTOR 通路與自噬機制密切相關，并且能夠參 與 調控 纖維化 疾病［9］。p70S6K 和4EBP1 作 為mTORC1 的下游因子，其磷酸化可以促進蛋白質合成。研究表明激活AMPK 通路、抑制mTOR/p70S6K通路可抑制心肌成纖維細胞的增殖，并減少細胞內的α－平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白［29］。ZHANG等［30］報道通過激活AMPK/mTOR 通路刺激人真皮成纖維細胞的自噬，能夠抑制該細胞的增殖和遷移以改善術后關節纖維化。此外，文獻報道通過調節AMPK/mTOR 通路激活自噬可以改善腸道炎癥和損傷。GAO 等［31］發現尼古丁具有激活AMPK/mTOR 通路，增加自噬水平從而降低潰瘍性結腸炎模型小鼠結腸損傷和炎性因子水平的作用。SU 等［32］也發現黃連素能夠調控AMPK/mTOR 通路降低潰瘍性結腸炎模型小鼠腸黏膜損傷，增加腸道菌群的豐度和有益菌的含量。因此，AMPK/mTOR 通路或許是改善CD 腸道纖維化的關鍵靶點。為探討TFA 調控IFs 細胞與AMPK/mTOR 通路是否存在聯系，本研究中使用AMPK 抑制劑CC 及mTOR 抑制劑RAPA 聯合TFA 處理IFs 細胞模型。發現TFA 聯合CC 處理IFs 細胞，會降低細胞中的自噬水平，促進Collagen Ⅰ的表達，而TFA 聯合RAPA處理IFs細胞，情況則與之相反。說明AMPK/mTOR 通路對TFA 干預IFs 細胞模型具有調控作用，激活AMPK/mTOR 通路能促進IFs 細胞的自噬，抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成。另外，實驗結果顯示，TFA 促進IFs 細胞中p－AMPK 蛋白表達，抑制p－mTOR、p－p70S6K、p－4EBP1蛋白水平，表明TFA能激活IFs 細胞的AMPK/mTOR 通路。TFA 可能通過激活AMPK/mTOR通路調節自噬來抑制IGF－1誘導腸道成纖維細胞中I型膠原蛋白的合成。

綜上所述，本研究以腸道成纖維細胞為研究對象，從細胞層面探索TFA 對CD 腸道纖維化的作用及機制。實驗發現，TFA 通過調控AMPK/mTOR 通路，促進腸道成纖維細胞自噬，抑制腸道成纖維細胞合成Ⅰ型膠原蛋白，進一步證實了TFA 具有改善CD 腸道纖維化的作用，為TFA 治療CD 腸道纖維化的應用提供了理論支持。但是，當前的研究只局限于體外實驗，未來仍有必要開展動物實驗，進一步驗證其中的機制。