拜顫停復(fù)方對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞自噬及凋亡機(jī)制研究

高鑫，王一晴，盧芳，陳平平，劉樹(shù)民

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩和肌強(qiáng)直三聯(lián)征為特點(diǎn)。西醫(yī)采用左旋多巴和外科手術(shù)的方法治療，但會(huì)產(chǎn)生毒副作用和神經(jīng)損傷后遺癥。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝腎陰血虧虛日久則筋失濡養(yǎng)，造成機(jī)體痙攣顫動(dòng)，采用方藥隨證加減治療PD，取得很好的臨床療效。本研究選擇的拜顫停復(fù)方是由臨床治療PD 的經(jīng)驗(yàn)方復(fù)元平顫寧［1］精制而得，由刺五加、白芍及鉤藤三味中藥組合而成。方中刺五加益氣補(bǔ)腎為君藥；白芍可養(yǎng)血柔肝為臣藥，助君藥滋養(yǎng)肝腎；鉤藤清熱平肝為佐藥。三藥合用，達(dá)到滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)氣養(yǎng)血之療效，可謂“標(biāo)本兼治”，前期研究表明其對(duì)PD療效顯著［2－3］。

現(xiàn)代研究表明，PD 的發(fā)生與細(xì)胞自噬和凋亡平衡失調(diào)有關(guān)［4－5］。自噬和凋亡的正常進(jìn)行可以使相關(guān)通路在腦組織中處于激活狀態(tài)，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞正常發(fā)育過(guò)程［6］。那么拜顫停復(fù)方的神經(jīng)保護(hù)及治療作用機(jī)理與調(diào)節(jié)自噬與凋亡過(guò)程是否有關(guān)？基于此問(wèn)題，本研究選擇采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性，明確拜顫停復(fù)方的神經(jīng)保護(hù)作用；采用流式細(xì)胞技術(shù)和熒光染色技術(shù)觀測(cè)細(xì)胞自噬、凋亡和死亡程度，明確用藥前后細(xì)胞自噬、凋亡和死亡方式變化；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PD 模型細(xì)胞中自噬與凋亡蛋白含量變化，明確自噬凋亡信號(hào)蛋白表達(dá)在PD中的情況，揭示拜顫停復(fù)方的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

SH－SY5Y 細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640培養(yǎng)液（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清），置于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1 藥材

刺五加藥材（批號(hào)：170634）購(gòu)自黑龍江省五常市世一堂中藥材有限公司，為五加科植物刺五加［Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms］的干燥根和根莖或莖；白芍藥材（批號(hào)：17052594）購(gòu)自安徽亳州市藥材總公司，為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根；鉤藤藥材（批號(hào)：17053549）購(gòu)自貴州劍河縣國(guó)鴻中藥材有限責(zé)任公司，為茜草科植物鉤藤［Uncaria rhynchophylla（Mia.）Miq.Ex Havil.］的干燥帶鉤莖枝。均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室王振月教授鑒定，符合2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。

1.2.2 制備方法

本研究使用的拜顫停復(fù)方中各味中藥的最佳配伍比例參考課題組前期實(shí)驗(yàn)所得［2－3］，最佳配伍比例為：刺五加提取物∶白芍提取物∶鉤藤提取物= 54.0∶45.0∶82.5。拜顫停復(fù)方按照《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的每日最高用量進(jìn)行換算。實(shí)驗(yàn)室自行制備拜顫停復(fù)方藥液，樣品保存在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院中藥藥性理論研究室（20190702）。

小鼠給藥量= 生藥量（g/60 kg）×9.1×出膏率

1.3 試劑

RPMI 1640 培養(yǎng)基（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：H20010304）；胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone 公司，批號(hào)：H107－50）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司，批號(hào)：H7589）；MPP+（北京謹(jǐn)明生物科技有限公司，批號(hào)：2018041023）；吖啶橙染色劑（西安百螢生物科技有限公司，批號(hào)：160110005）；SDS－PAGE 凝膠配制試劑盒（美國(guó)Biosharp 公司，批號(hào)：BL508A）；Tween 20（德國(guó)BIOFROXX 公司，批號(hào)：1247ML100）；Western blot一抗二抗去除液（上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：P00258）；Albumin Bovine V（美國(guó)Amresco 公司，批號(hào)：0332）；飛克特超敏ECL 發(fā)光液（Meilunbio，批號(hào)：MA0186－L）；Beclin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs－1353R）；LC3B（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：18725－1－AP）；p53（英國(guó)abcam公司，批號(hào)：Ab26）；AMPK（英國(guó)abcam 公司，批號(hào)：Ab80039）；mTOR（英國(guó)abcam 公司，批號(hào)：Ab2732）；Bax（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs－0127R）；Bcl－2（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs－0032R）；Casepase－3（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs－0081R）；GAPDH（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs－10900R）。

1.4 儀器

HF90 CO2培養(yǎng)箱（香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)）；熒光顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；KDC－160HR 高速冷凍離心機(jī)（安徽科大創(chuàng)新股份有限公司）；UV－2450 紫外分光光度計(jì)（日本島津）；DP72 顯微攝像系統(tǒng)（日本奧林巴斯有限公司）；Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析儀（北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司）；全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信科技）；全波長(zhǎng)讀數(shù)儀（Thermo）；Trans－blot 轉(zhuǎn)膜儀（Thermo）；Pharos FX 激光成像系統(tǒng)（Bio－Rad）；Guava easycyte 流式細(xì)胞儀。

1.5 方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將SH－SY5Y細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、拜顫停復(fù)方組和3－MA組。拜顫停復(fù)方組的給藥劑量為193.6 μg/mL（課題組前期實(shí)驗(yàn)篩選所得的最佳劑量［7－9］），且拜顫停復(fù)方對(duì)細(xì)胞的毒性作用甚微，可以忽略不計(jì)［10］。正常對(duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，其余各組均加入0.437 mmol/L 的MPP+干預(yù)。2 h 后，拜顫停復(fù)方組加入193.6 μg/mL濃度拜顫停藥液，3－MA組加入193.6 μg/mL拜顫停藥液和5 mmol/L 3－MA試劑。

1.5.2 PD細(xì)胞模型活性實(shí)驗(yàn)

選擇MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性。96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37 ℃培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，靜置于細(xì)胞培養(yǎng)箱2 h 后吸去上清液，加入Formazan 溶解液150 μL，水平搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，選擇波長(zhǎng)為490 nm，記錄結(jié)果并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活性。

細(xì)胞活性（%）=（給藥組OD值－空白組OD值）/（模型組OD值－空白組OD值）×100%

1.5.3 PD細(xì)胞模型凋亡實(shí)驗(yàn)

依據(jù)Annexin V－FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4 PD細(xì)胞模型自噬實(shí)驗(yàn)

選擇吖啶橙染色法。取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入吖啶橙（1 mg/mL）避光染色15 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。每張片取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)5 個(gè)視野中每100 個(gè)細(xì)胞中染色陽(yáng)性（有自噬囊泡）的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而計(jì)算吖啶橙染色自噬囊泡細(xì)胞數(shù)目的百分?jǐn)?shù)。

1.5.5 PD細(xì)胞模型自噬與凋亡蛋白實(shí)驗(yàn)

選擇Western blot 檢測(cè)方法。上樣后連接電泳儀，起始電壓為80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)跑到分離膠后，提高電壓到120 V，至溴酚藍(lán)達(dá)分離膠底部，電泳結(jié)束。海綿和PVDF 膜用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡，去掉濃縮膠后與其一起放入濕轉(zhuǎn)電泳槽中，連接電泳儀，選擇電壓110 V，電泳100 min。電泳完畢后將膜浸于5%封閉液中，置于搖床，室溫封閉2 h。封閉結(jié)束結(jié)合一抗，然后結(jié)合二抗，最后將膜浸于ECL發(fā)光液中，避光顯色2 min，置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)PD細(xì)胞模型活性的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞活性極顯著降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05），3－MA 組細(xì)胞活性無(wú)顯著變化（P ＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組PD細(xì)胞模型活性比較（±s）

表1 各組PD細(xì)胞模型活性比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，##P ＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

?

2.2 對(duì)PD細(xì)胞模型凋亡的影響

從流式細(xì)胞FITC/PI散點(diǎn)圖可以看出，正常對(duì)照組散點(diǎn)主要集中在3 區(qū)，而且由于操作等原因?qū)е碌臋C(jī)械致死細(xì)胞很少。模型對(duì)照組散點(diǎn)主要集中在2 區(qū)和4 區(qū)，凋亡早期、凋亡晚期和壞死細(xì)胞數(shù)量較多；3區(qū)散點(diǎn)較少，活細(xì)胞較少。與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組散點(diǎn)主要分布于3區(qū)和4區(qū)，活細(xì)胞數(shù)量較模型對(duì)照組提高且明顯，凋亡早期細(xì)胞數(shù)量較模型對(duì)照組減少；2 區(qū)幾乎沒(méi)有散點(diǎn)分布，晚期凋亡或壞死細(xì)胞很少。與模型對(duì)照組比較，3－MA 組散點(diǎn)主要分布于2 區(qū)和4 區(qū)，樣本細(xì)胞凋亡程度高；3 區(qū)散點(diǎn)零星分布，活細(xì)胞數(shù)量少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組PD細(xì)胞模型凋亡情況

2.3 對(duì)PD細(xì)胞模型自噬的影響

吖啶橙染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組黃綠色熒光數(shù)量較多，自噬囊泡數(shù)顯著降低（P＜0.05），自噬程度高；拜顫停復(fù)方組黃綠色熒光數(shù)量回調(diào)，自噬囊泡數(shù)顯著升高（P＜0.05），即拜顫停復(fù)方組含有自噬囊泡細(xì)胞數(shù)量回調(diào)；3－MA 組黃綠色熒光數(shù)量較少，自噬囊泡數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），即3－MA 組含有自噬囊泡數(shù)量與模型對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2和圖2。

圖2 各組PD細(xì)胞模型自噬情況

表2 各組PD細(xì)胞模型自噬囊泡數(shù)目比較（±s）

表2 各組PD細(xì)胞模型自噬囊泡數(shù)目比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組拜顫停復(fù)方組3－MA組自噬囊泡數(shù)目（%）30.54±2.20 6.48±1.94#22.96±1.18*5.21±1.23

2.4 對(duì)PD細(xì)胞模型自噬、凋亡蛋白的影響

利用蛋白質(zhì)免疫印跡法觀察拜顫停復(fù)方對(duì)細(xì)胞自噬及凋亡的影響。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Bax蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組Bax蛋白含量顯著降低（P＜0.05），3－MA 組Bax蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Bcl－2 蛋白含量顯著降低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組Bcl－2顯著升高（P＜0.05），3－MA組Bcl－2蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Caspase蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組Caspase 蛋白含量顯著降低（P＜0.05），3－MA 組Caspase 蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組LC3B 蛋白顯著降低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組LC3B蛋白顯著升高（P＜0.05），3－MA組LC3B蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組AMPK蛋白顯著升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組AMPK 蛋白顯著降低（P＜0.05），3－MA 組AMPK 蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組mTOR 蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組mTOR 蛋白含量顯著降低（P＜0.05），3－MA 組mTOR蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Beclin蛋白含量顯著降低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組Beclin蛋白含量顯著升高（P＜0.05），3－MA 組Beclin蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組p53蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，拜顫停復(fù)方組p53蛋白含量顯著降低（P＜0.05），3－MA 組p53蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組PD細(xì)胞模型自噬、凋亡蛋白表達(dá)量比較（±s，%）

表3 各組PD細(xì)胞模型自噬、凋亡蛋白表達(dá)量比較（±s，%）

注：與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組拜顫停復(fù)方組3－MA組Bax 51.94±2.33 128.00±1.47#79.28±1.72*105.63±2.12 Bcl－2 125.38±1.29 88.23±1.69#110.41±2.42*79.58±2.57 Caspase 51.42±1.83 110.47±1.86#63.63±2.42*92.13±2.17 LC3B 98.27±1.71 45.83±2.44#103.73±1.42*71.68±1.98 AMPK 67.42±1.43 75.98±1.32#61.45±2.71*79.32±1.09 mTOR 73.71±2.48 116.85±2.23#79.01±1.42*121.33±1.92 Beclin 125.31±1.39 72.91±1.12#106.92±1.57*79.38±1.04 p53 75.92±2.33 106.02±1.13#79.47±2.19*89.48±1.87

圖3 各組PD細(xì)胞模型自噬、凋亡蛋白情況

3 討論

細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系是錯(cuò)綜復(fù)雜的，在病毒、感染和饑餓等應(yīng)激條件下，細(xì)胞自噬被誘導(dǎo)發(fā)生，當(dāng)持續(xù)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞病變無(wú)法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞凋亡則被激活，自噬和凋亡過(guò)程中涉及的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的雙重調(diào)節(jié)作用成為近年來(lái)研究?jī)烧哧P(guān)系的重點(diǎn)［11－12］。那么拜顫停復(fù)方治療PD 的機(jī)制是否是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬與凋亡實(shí)現(xiàn)的？基于此，本課題組展開(kāi)了相關(guān)研究。

PD 細(xì)胞模型活性影響的實(shí)驗(yàn)中，拜顫停復(fù)方可以減弱MPP+對(duì)SH－SY5Y 細(xì)胞的毒性作用，從而保護(hù)神經(jīng)元；3－MA 組細(xì)胞活性低于拜顫停復(fù)方組，與模型對(duì)照組類(lèi)似，推測(cè)拜顫停復(fù)方保護(hù)神經(jīng)元的作用是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)自噬被主動(dòng)抑制時(shí)，拜顫停復(fù)方的作用效果減弱。

PD 細(xì)胞模型凋亡的影響實(shí)驗(yàn)與吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組熒光幾乎淬滅，總體凋亡趨勢(shì)明顯，自噬程度低，符合MPP+對(duì)細(xì)胞的毒性損傷［13－14］。拜顫停復(fù)方組自噬程度提高，凋亡被抑制，反映了其神經(jīng)保護(hù)作用。3－MA 組熒光淬滅程度與模型組相似，說(shuō)明抑制細(xì)胞自噬會(huì)降低拜顫停復(fù)方的作用效果，推測(cè)復(fù)方主要通過(guò)促進(jìn)自噬發(fā)揮作用。

為深入探索拜顫停復(fù)方調(diào)控的自噬和凋亡相關(guān)蛋白以及具體的調(diào)控方式進(jìn)行了自噬、凋亡蛋白影響實(shí)驗(yàn)。Bax 和Bcl－2 是自噬與凋亡主要的活性調(diào)控因子，Bax 被激活會(huì)從胞漿中轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，導(dǎo)致細(xì)胞色素的釋放，從而引起細(xì)胞凋亡。Bax 相對(duì)量多于Bcl－2 時(shí)，細(xì)胞凋亡被促進(jìn)，反之則被抑制［15］。Caspase 蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Caspase－3 直接作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑和內(nèi)源凋亡途徑，激活后凋亡將不可逆轉(zhuǎn)［16］；Caspase－9 會(huì)在外源凋亡途徑中誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C 從而使細(xì)胞凋亡［17］；故Caspase－3 和Caspase－9 會(huì)以?xún)?nèi)外聯(lián)動(dòng)的方式加速細(xì)胞凋亡。LC3B 是自噬小體膜蛋白的一種亞型，它是可檢測(cè)自噬發(fā)生的標(biāo)志性蛋白［18－19］，Beclin 是與自噬調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵因子，ULK1的激酶通過(guò)磷酸化Beclin，誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬發(fā)生［20］，這兩種因子在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)量與自噬呈正相關(guān)。AMPK/mTOR/p53 是機(jī)體一條調(diào)控自噬－凋亡的重要途徑，激活此通路可延長(zhǎng)細(xì)胞存活周期，使凋亡得到抑制［21－22］。其中，AMPK 能夠通過(guò)切斷細(xì)胞能量供應(yīng)使其凋亡。p53 激活后會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)AMPK 亞基的表達(dá)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)凋亡。同時(shí)隨著p53 的增高，AMPK 的磷酸化水平被促進(jìn)，mTOR 的磷酸化水平受到抑制［23－24］，促自噬抑凋亡。因此，病理模型中能夠促進(jìn)自噬的蛋白如Bcl－2、LC3B、AMPK、Beclin、p53明顯下調(diào)，促進(jìn)凋亡的蛋白如Bax、Caspase、mTOR 明顯上調(diào)；經(jīng)拜顫停復(fù)方干預(yù)后自噬和凋亡蛋白變化趨勢(shì)相反。自噬被抑制后，復(fù)方抑制凋亡作用減弱。

綜上所述，拜顫停復(fù)方通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元自噬，干預(yù)了自噬與凋亡平衡，從而反饋性抑制凋亡，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用，從而治療PD。本研究從自噬和凋亡的角度揭示拜顫停復(fù)方防治PD 的新機(jī)制，為PD 的治療提供新的靶點(diǎn)和療法。