同源盒基因10調控胰島素樣生長因子結合蛋白3與腸癌細胞5-氟尿嘧啶抵抗的關系研究

張言言，韓 剛，曹 羽，張 云，張 旭，胡 建，龔航軍

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院胃腸外科,上海 200021)

結直腸癌為全球病死率第四癌癥，約占全球因腫瘤或腫瘤相關疾病死亡人數的10%[1]。對于進展期的結直腸癌，根治效果較差。以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為主的化療對于預防腫瘤復發轉移和提高患者生存率具有一定的作用，但是由于耐藥問題而出現化療失敗[2-5]。因此，開展分子靶點研究有助于增強化療藥物療效，提高患者生存率。

同源盒基因(Homeobox gene，HOXD)家族近年來報道為靶向致癌相關蛋白的重要轉錄因子[6-10]，其中HOXD10被認為是負調節結直腸癌轉移的主要效應物，其表達受DNA甲基化的調控，在結直腸癌中出現高甲基化低mRNA表達的情況[11-15]。此外，有文獻報道胰島素樣生長因子結合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)是HOXD10的轉錄靶點，而IGFBP3作為胰島素樣生長因子通路的主要結合分子，在結直腸癌的發生發展中也發揮著重要的作用[16-17]。盡管HOXD10-IGFBP3調控軸在結直腸癌進展中起到關鍵作用，但是否與化療藥物抵抗有關，目前報道較少。

本研究擬分析HOXD10和IGFBP3在原代腸癌細胞及耐藥株細胞中表達情況，證實HOXD10和IGFBP3在腸癌中的調控關系，明確HOXD10- IGFBP3調控軸對腸癌耐藥表型的影響，為腸癌患者精準化療提供干預靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人結直腸癌細胞SW480購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心；DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司；細胞用青霉素和鏈霉素購自上海碧云天生物技術有限公司；總RNA分離提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司； siRNA轉染試劑Lipofectamine TM 3000試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄-實時熒光定量PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、鼠抗人GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠及抗兔二抗購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL化學發光試劑盒購自Millipore公司；HOXD10、IGFBP3蛋白一抗購自CST公司；引物、siRNA及HOXD10過表達質粒由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；5-Fu購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及5-Fu耐藥株獲得：人結直腸癌細胞SW480購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。用含10%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素和 100 U/ml青霉素的DMEM高糖培養液，置于27 ℃、5% CO2的培養箱中培養。收集對數生長期的細胞用于后續實驗。5-Fu用DMSO配成母液后分裝凍存。候選試驗將母液用DMEM稀釋配制。本實驗室采用較大劑量間歇誘導法進行篩選,再采用濃度梯度遞增法作用,至SW480細胞可長期在5-Fu濃度為2.0 mg/L的細胞培養液中穩定生長。

1.2.2 實驗分組：根據SW480腸癌細胞對5-Fu是否耐藥，分為5-Fu耐藥細胞組和5-Fu原代細胞組。對于靶基因敲減實驗：①HOXD10敲減，分為對照組(NC)即siRNA陰性對照，以及2條HOXD10 siRNA敲減組分別為siHOXD10-1和siHOXD10-2。②IGFBP3的敲減，分為對照組(NC)即siRNA陰性對照，以及2條IGFBP3 siRNA敲減組分別為siIGFBP3-1和siIGFBP3-2。對于靶基因過表達試驗，分為空載轉染(EV)及HOXD10過表達(pCMV-HOXD10)組。

1.2.3 siRNA、過表達質粒構建及細胞轉染：siRNA陰性對照序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。HOXD10的2條特異siRNA序列分別為siHOXD10-1：5’-CCGAACAGAUCUUGUCGAATT-3’；siHOXD10-2：5’-GAUAAGCGCAACAAACUCATT-3’。IGFBP3的2條特異siRNA序列分別為siIGFBP3-1：5’-GCACAGAUACCCAGAACUUUU-3’；siIGFBP3-2：5’-GCACAGAUACCCAGAACUU-3’。空載質粒為pcDNA3.1，并在此質粒上構建HOXD10過表達載體。siRNA及所有載體轉染腸癌細胞株按脂質體轉染試劑Lipofectamine 3000說明書進行操作。

1.2.4 實時熒光定量PCR:總RNA提取、逆轉錄及熒光定量PCR按試劑盒說明書操作。Real-time定量PCR條件為95 °C 10 min后,95 °C 15 s，60 °C 1 min，40 循環。Real-time定量PCR使用ABI 7500儀器進行。根據待測標本的Ct值，以GAPDH作為內參照，采用2-△△Ct法計算相對表達倍數變化。其中各基因引物為HOXD10：F:5’-GACATGGGGACCTATGGAATGC-3’，R:5’-TGGTGGTTCACTTCTCTTTTGG-3’；IGFBP3：F:5’-GGCAGATGAAGCAGGATGTA-3’，R:5’-GACAGCAGTGTCTTGTTGTTG-3’；GAPDH：F:5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，R:5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。

1.2.5 蛋白免疫印跡(WB)：采用RIPA裂解每組樣品抽提總蛋白，根據BCA試劑盒說明書進行蛋白定量。每組細胞取50 μg蛋白上樣，在10%的SDS-PAGE中進行電泳2 h，然后將蛋白轉膜至甲醇預處理的PVDF膜1 h，以5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入1∶1000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，次日PBST漂洗3次，每次10 min，加入1∶5000稀釋的HRP標記的二抗室溫孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min后，用ECL化學發光液曝光顯色。

1.2.6 CCK-8實驗：對照組及處理組胰腺癌細胞以1×105細胞接種96孔板，加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，繼續培養4 h。通過酶標儀測量該樣品在450 nm處的吸光度值。

1.2.7 細胞克隆形成實驗：取對數生長期細胞以500個/孔細胞接種與6孔板，培養7～14 d，待有單克隆生長進行4%多聚甲醛固定，0.2%結晶紫染色，用水洗滌，晾干，照片計數。

2 結 果

2.1 耐藥細胞組與原代細胞組對5-Fu敏感性比較 利用CCK-8實驗，發現SW480耐藥株在各5-Fu濃度下(2.5、5、10 μg/ml)的增殖活性，與0 μg/ml的5-Fu增殖活性無統計學差異(均P>0.05)。而原代SW480細胞在5 μg/ml的增殖活性出現下降，與0 μg/ml的5-Fu增殖活性相比有統計學差異(均P<0.01)。見表1。

表1 原代及耐藥細胞組在不同5-Fu濃度下細胞增殖活性比較

2.2 HOXD10及其靶基因IGFBP3在耐藥細胞組及原代細胞組中表達的比較 qPCR結果表明耐藥細胞組HOXD10的相對表達倍數(0.51±0.096)與原代細胞組(1.00±0.091)比較下調，兩組表達比較有統計學差異(t=6.486,P=0.0029)；而耐藥細胞組的IGFBP3相對表達倍數(4.21±0.32)顯著高于原代細胞組(1.00±0.22)，兩組表達比較有統計學差異(t=14.12,P=0.0001)。WB也證實了耐藥細胞組較原代細胞組有較低的HOXD10和更高的IGFBP3表達水平(圖1)。

圖1 原代及耐藥細胞組HOXD10、IGFBP3表達

2.3 過表達或敲減HOXD10水平對IGFBP3表達的影響 我們成功在原代細胞組中進行HOXD10的敲減，2條siRNA均減低HOXD10表達水平，同時IGFBP3的表達水平較對照組增高(圖2)。此外，我們在耐藥細胞組中過表達HOXD10，IGFBP3的表達水平較對照組顯著減低(圖3)。

圖2 原代細胞組敲減后IGFBP3表達變化

圖3 耐藥細胞組過表達后IGFBP3表達變化

2.4 敲減IGFBP3對5-Fu誘導作用耐藥細胞組增殖活性的影響 如圖4所示，IGFBP3兩條特異性siRNA轉染耐藥組細胞，并成功敲減IGFBP3的表達水平。我們將對照組及兩個敲減組細胞進行各濃度的5-Fu處理，利用CCK-8發現：NC組各濃度處理下的細胞增殖活性比較無統計學差異(均P>0.05)，siIGFBP3-1組細胞在5 μg/ml濃度下出現細胞增殖活性下降，與0 μg/ml濃度比較有統計學差異(P<0.05)，siIGFBP3-2組細胞在2.5 μg/ml濃度下出現細胞增殖活性下降，與0 μg/ml濃度比較有統計學差異(P<0.05)，見表2。細胞克隆試驗表明：siIGFBP3-1組細胞(克隆形成數：12.00±2.00個)及在siIGFBP3-2組細胞(克隆形成數：9.00±2.00個)在5 μg/ml的5-Fu濃度下的克隆形成數，與對照組(克隆形成數：45.00±3.00個)比較，顯著減少(siIGFBP3-1組細胞與對照組比較，t=21.53，P<0.0001；siIGFBP3-1組細胞與對照組比較t=23.45，P<0.0001)，見圖5。

圖4 在耐藥組中轉染IGFBP3兩條siRNA后IGFBP3的表達變化

表2 對照組、siIGFBP3-1及siIGFBP3-2組耐藥細胞在不同5-Fu濃度下細胞增殖活性比較

圖5 對照組、siIGFBP3-1及siIGFBP3-2組耐藥細胞在5 μg/ml的5-Fu濃度下的克隆形成數比較(結晶紫染色，×4)

2.5 過表達HOXD10對5-Fu誘導作用耐藥腸癌細胞株增殖活性的影響 如表3所示，空載轉染耐藥細胞株在各藥物5-Fu濃度下與0 μg/ml細胞增殖活性比較無統計學差異(P>0.05)，HOXD10過表達耐藥細胞株在5～10 μg/ml濃度下細胞增殖活性下降，與0 μg/ml細胞增殖活性比較有統計學差異(P<0.0001)。細胞克隆試驗表明(圖6)，在耐藥細胞中過表達HOXD10后，耐藥細胞組在5 μg/ml細胞克隆數(6.00±1.00個)顯著減低，與空載轉染耐藥細胞組克隆形成數(45.00±2.00個)相比顯著較少，比較有統計學差異(t=30.21，P<0.0001)。

表3 空載轉染及HOXD10過表達耐藥細胞組在不同5-Fu濃度下細胞增殖活性的比較

圖6 空載轉染及HOXD10過表達耐藥細胞在5 μg/ml的5-Fu濃度下的克隆形成數比較(結晶紫染色，×4)

3 討 論

結直腸癌耐藥抵抗是臨床亟待解決問題，本研究揭示了HOXD10及其靶基因IGBPF3在腸癌5-Fu耐藥株中的重要作用。本實驗室前期成功獲得了5-Fu耐藥的腸癌細胞株SW480。此耐藥株在5-Fu各藥物濃度(5～20 μg/ml)下與0 μg/ml的5-Fu增殖活性無顯著變化，而原代細胞則顯著下降，表明本研究耐藥組誘導成功，可用于候選研究。近年研究發現，HOXD10在包括腸癌在內的如腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、消化道等多種實體腫瘤中表達失活[11-17]，并且過表達HOXD10可發揮如細胞增殖抑制、轉移和侵襲減低等抑癌活性。本研究揭示HOXD10表達在腸癌耐藥株細胞比原代細胞更低；同時在耐藥株中過表達HOXD10后，耐藥株對5-Fu敏感性增強，細胞克隆形成能力顯著減低，表明HOXD10與腸癌5-Fu抵抗有著密切聯系。

既然HOXD10與腸癌細胞5-Fu敏感性有關，那么HOXD10作為轉錄因子可能通過調控其靶基因發揮生物學作用。近年有文獻報道，HOXD10可在腫瘤細胞內結合IGFBP3啟動子，抑制其轉錄表達[15-16]。高水平IGFBP-3被廣泛認為與腫瘤轉移和侵襲有關[18-20]，但在腸癌5-Fu報道研究較少。本研究發現IGFBP-3在耐藥組中表達較原代細胞表達更高，提示IGFBP3在耐藥抵抗起到關鍵作用。為確認HOXD10在腸癌耐藥株中對IGFBP3的調控作用，我們在耐藥組細胞中過表達HOXD10，結果發現IGFBP3表達水平被顯著抑制；而我們在原代細胞中敲減HOXD10后，IGFBP3的表達水平明顯增加，上述結果證實了HOXD10-IGFBP3調控軸的確在腸癌耐藥株中存在。

那么IGFBP3是否與腸癌耐藥表型有關呢？我們在耐藥組中進行IGFBP3敲減，結果發現耐藥組對5-Fu敏感性增強，細胞增殖活性顯著減弱，細胞克隆形成能力下降，表明IGFBP3高水平與維持腸癌耐藥表型有緊密聯系，而高水平IGFBP3由于失去低水平表達HOXD10調控有關。

綜上所述，腸癌耐藥株與原代細胞相比具有低水平的HOXD10及更高表達的IGFBP3。在腸癌原代細胞及耐藥細胞中調節HOXD10表達可顯著影響IGFBP3的表達。腸癌耐藥株中過表達HOXD10或敲減IGFBP3可增強耐藥株對5-Fu的敏感性，靶向作用HOXD10-IGFBP3調控軸可能在減緩腸癌5-Fu化療抵抗及增強治療效果中具有臨床轉化價值。