達格列凈對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護的實驗研究

張 銘，張娜娜，余 信，周國瓊,李 靜

(1.西安交通大學醫學院附屬紅會醫院，陜西 西安710054；2.陜西省人民醫院中醫科，陜西 西安710068)

全球近三分之一的死亡是由心血管疾病引起[1]，其中，急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是心血管疾病死亡的主要原因。AMI是由于動脈內壁形成的斑塊導致流向心臟的血液減少，心肌組織因缺血缺氧而導致心肌細胞死亡[2]。目前AMI的治療方法是盡早開通血管恢復心臟的血液灌注，這一過程被稱為再灌注[3]。再灌注可通過外科手術和經皮冠狀動脈介入球囊血管成形術[4-5]，或抗血小板、抗血栓治療來完成[6-7]。然而，再灌注本身又可引起心肌細胞死亡和梗死面積增大，從而增加AMI患者的病死率，這一過程被稱為“缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion，I/R)損傷”[8]。因此，心臟I/R損傷后保護心肌組織的治療可能有助于在結構和功能上保護AMI患者的心臟。

鈉-葡萄糖共轉運蛋白2 (Sodium glucose cotransporter 2，SGLT-2)抑制劑是一種治療糖尿病的新藥，已被證明具有良好的代謝特征， 最初認為SGLT-2抑制劑只是一種降糖藥物，但其作用已經遠遠超出了這一范圍[9-10]。 EMPA-REG試驗研究報告了SGLT-2抑制劑對心血管的益處， SGLT-2抑制劑可促進糖尿的排出，從而降低葡萄糖毒性和體重，并增強利鈉，從而降低血壓，可顯著降低心力衰竭患者的住院率，減少動脈粥樣硬化事件、心血管疾病的總病死率，還可控制慢性腎臟疾病的進展[11-12]。盡管SGLT-2抑制劑對心血管的益處從血流動力學和全身代謝方面進行了解釋，但對心臟潛在的保護機制尚不明確。本研究旨在探討在心臟I/R損傷3個不同時間點急性給藥達格列凈對大鼠心肌梗死面積及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性大鼠40只,250～300 g,8周齡，購自長沙天勤生物公司[SCXK( 湘) 2019-0013 ],馴化7 d后接受同等程度的心臟I/R刺激。40只隨機分為四組，每組10只。①預處理組：在心肌缺血前15 min快速給予達格列凈；②缺血組：在心肌缺血開始15 min后快速給予達格列凈；③再灌注組：再灌注開始時快速給予達格列凈；④對照組：給大鼠生理鹽水作為對照。將達格列凈溶于生理鹽水中(1 mg /kg溶于1 ml生理鹽水)，定位大鼠左側股靜脈，注入達格列凈注射液。從右側頸動脈插入P-V導管至左室，評估心功能。記錄室速(VT)/室顫(VF)首次發生的時間，對心律失常進行量化分析。在I/R損傷結束時，立即切除心臟，以便對心肌高風險區和心肌梗死面積的測量。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌缺血再灌注模型:用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)對大鼠進行麻醉，通過呼吸模式、眼睛和腳蹬反射的測定，密切監測麻醉水平。對大鼠進行氣管插管，接動物專用簡易呼吸機，接心電圖并記錄Ⅱ導聯心電圖。開胸、切開心包，暴露大鼠心臟，結扎左冠狀動脈前降支(LAD)致心肌缺血30 min，通過心外膜發紺和心電圖ST段抬高，證實成功的冠狀動脈閉塞和MI起始。解除LAD結扎后心臟恢復再灌注120 min[13-14]。心電圖ST段壓低證實再灌注，左心室區出現局部充血，之前是局部缺血，顏色蒼白。

1.2.2 心律失常參數與左室功能測定:根據朗伯斯公約指南[15]對心律失常進行量化，分析每只大鼠缺血性心律失常發作的差異。

1.2.2.1 左室功能測量：在心臟I/R損傷時，定位右側頸動脈，插入P-V環導管至左室，評估左室功能。采用Labscribe程序測定心率(HR)、左室收縮壓和舒張壓(LVESP和LVEDP)、左室內壓變化率(dp/dtmax)、左室舒張期壓力下降最大變化率(dp/dtmax)、每搏輸出量(SV)和左室射血分數(LVEF)[13-15]。P-V環數據分析:①選擇缺血前50個循環作為基線；②冠脈閉塞結束時選擇50個循環代表缺血期；③再灌注結束時選擇50個循環代表再灌注期。

1.2.2.2 梗塞尺寸測量:再灌注120 min后將伊文思藍注入大鼠主動脈內，然后處死大鼠，快速取出心臟。評估左室危險區域(AAR)面積。將心臟置于-20 ℃的低溫下，第2天早晨取出后切片，厚度為1～2 mm。將切片后的心臟浸泡于2,3,5-三苯基四唑(TTC)緩沖鹽水中。TTC染色區域為活組織，用紅色染色檢測。梗死面積由白色區域確定，沒有任何染料染色。使用圖像分析程序對梗死面積(IS)和高風險區域面積(AAR)的百分比進行計算，各心臟的AAR值和IS值通過對切片數據進行匯總并計算平均值得到。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行統計學分析。實驗數據分析均按隨機化進行。數據以均數±標準差表示，用單因素方差分析和t檢驗來測試組間的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 達格列凈對各組心肌梗死面積的影響 達格列凈在缺血再灌注大鼠模型中對心肌高風險區面積的影響，實驗結果預處理組、缺血組、再灌注組與對照組比較差異沒有統計學意義(均P>0.05)，說明四組之間心肌高風險面積大小無差異。達格列凈在缺血再灌注大鼠模型中對心肌梗死面積的影響時，發現給予達格列凈治療后，預處理組和缺血組與對照組比較差異有統計學意義(均P<0.05)，可顯著減少心肌梗死的面積；再灌注組與對照組比較差異沒有統計學意義(P>0.05)，心肌梗死面積沒有顯著減少。見表1。

表1 達格列凈對各組心肌梗死面積的影響(%)

2.2 達格列凈對各組心肌I/R期間心律的影響 考察達格列凈對I/R期間心律的影響，結果發現預處理組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明在缺血前期給予達格列凈可延長大鼠第1次發生VT/VF的時間，減少心臟I/R損傷心律失常的頻次。而缺血組和再灌注組與對照組比較差異無統計學意義(均P>0.05)。說明在缺血時以及再灌注時給予達格列凈治療并不能延長大鼠第1次發生VT/VF的時間,減少I/R期間的心律失常。見表2。

表2 達格列凈對各組I/R期間心律的影響(min)

2.3 達格列凈對心肌I/R損傷時左室功能的影響 考察達格列凈對心肌I/R損傷時左室功能的影響，結果發現LV功能在基線時四組之間各參數比較差異沒無統計學意義(均P>0.05)。LAD閉塞后，每搏輸出量(SV)、dp/dtmax、dp/dtmin和左室射血分數(LVEF)均逐漸下降，舒張末期壓逐漸升高(圖1A-F)。給予達格列凈治療后，缺血組和再灌注組與對照組比較，在HR、SV、dp/dtmax、dp/dtmin以及LVEF等參數上差異沒有無統計學意義(均P>0.05)，預處理組與對照組比較，在HR、SV、 ESP、dp/dtmin等參數上沒有統計學差異(均P>0.05)；而在EDP、dp/dtmax和LVEF%參數上比較差異具有統計學意義(均P<0.05)。達格列凈處理的預處理組dp/dtmax和LVEF%有所改善(圖1E、G)。

A:HR(次/min);B：SV(μl);C：ESP(mmHg);D：EDP(mmHg);E：dp/dtmax(mmHg/s×103);F：dp/dtmin(mmHg/s×103);G：LVEF%

3 討 論

缺血心肌的快速再灌注在幾十年前就被確立為是一種非常有益的心肌梗死治療方法，但在再灌注恢復后仍會發生明顯的心肌細胞死亡。因此，心臟I/R損傷是AMI發病和死亡的重要原因。目前我們的實驗研究還沒有發現直接有效的治療方法來保護心臟免受IR損傷。因此，有必要發現或開發新的策略來預防心肌再灌注損傷，以改善心血管患者的臨床結局。EMPA-REG試驗揭示了SGLT-2抑制劑在降血糖的同時對患者心血管事件的影響，它對心臟的保護作用是通過降低血糖、血壓、改善血管彈性、通過尿鈉的排出減少心臟負荷、降低體重等全身作用而發揮心臟保護作用[16-19]。

本研究發現了達格列凈的益處可能主要是由于其對心臟的直接作用，因為它是在心臟I/R損傷前15 min才給予大鼠。本實驗研究通過以下幾個方面的數據:①LVEF %增加，LV功能得到改善；②首次VT/VF發生時間的延遲；③心肌梗死面積的減小，表明在心臟I/R損傷期間，急性給藥達格列凈可直接發揮心臟保護作用，改善心功能，并且在I/R損傷不同時間點給藥，發揮的心臟保護作用是不同的。我們的研究證實，在心臟I/R損傷前急性給藥達格列凈可以減少心肌梗死面積約38%，在心臟缺血期間急性給藥達格列凈可以減少心肌梗死面積約14%。除梗死面積減少外，研究還證實，與對照組相比，缺血前急性給藥達格列凈可使大鼠VT/VF的首次發病時間明顯延遲，心律失常的頻次減少，左室功能參數LVEF、dp/dtmax有所改善。因此，在心臟I/R損傷前急性給藥達格列凈可通過減少心肌梗死面積、控制心律失常來發揮心臟保護作用，通過提高LVEF、dp/dtmax來改善左室功能。

缺血/再灌注損傷是一種嚴重的疾病，對我們醫生提出了一個重要的治療挑戰，人們已經在I/R損傷的途徑及引起的代謝紊亂方面做了大量的工作。SGLT-2抑制劑對心臟的直接保護作用可能是通過改善心肌局部炎癥、活性氧的失控生成而減少心肌細胞凋亡、自噬、壞死，使活性心肌細胞得到保護，通過降低心肌氧化應激、纖維化和心臟重構的途徑使心肌梗死面積得到減少，通過維持線粒體的正常生物功能和細胞能量代謝等途徑而控制心律失常、改善心功能[20-22]，目前還需要我們進一步實驗研究以證實。這些發現可以為今后急性心肌梗死患者使用達格列凈的臨床研究提供重要的依據。