雙氫青蒿素對放射性肺損傷小鼠肺部炎癥和氧化應激的作用*

蒙灣灣，趙偉東，李麗清，王瑜丹，梁世雄

（1.廣西醫科大學，南寧 530021；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院放療科，南寧 530021）

放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）是臨床上最常見的胸部腫瘤放射治療的并發癥之一，總體發生率約為20%～36%[1]，有研究顯示，RILI發病率最高的是肺癌（5%～25%），其次是縱隔淋巴瘤（5%～10%）和乳腺癌（1%～5%）[2]。RILI限制了放射治療的劑量并影響患者的治療效果和預后，是發生非原發病因死亡的主要原因之一。細胞因子學說是RILI發病機制的研究熱點，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是RILI發生、發展過程中非常重要的細胞因子，在RILI生成的活性氧自由基（reactiveoxygen species，ROS）刺激下，TGF-β、TNF-α大量產生[3-4]。同時，在照射過程中ROS本身也是RILI產生的重要原因[5]。這使抗氧化成為防治放射性肺損傷的重要研究方向。

雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的衍生物，是高效、速效、低毒的抗瘧藥[6-7]。有研究發現，DHA能通過作用于TLR4/NF-κB通路，抑制NF-κB的激活，調控TGF-β、TNF-α等多種炎癥因子的表達從而實現抗炎效果[8]。為此，本研究通過復制小鼠RILI模型，觀察DHA對肺組織TNF-α、TGF-β、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及ROS表達的影響，以探討DHA對RILI的干預作用，為RILI的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器

健康SPF級C57BL/6小鼠54只，雄性，6～8周齡，體重20～25 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心（許可證號：SCXK桂2020-0003），采用標準飼料喂養，自由飲水和飲食，適應性飼養1周后進行實驗。DHA購自Selleck公司，批號為S 229009；常規蘇木精—伊紅（HE）染色、免疫組化及TGF-β、TNF-α檢測所需試劑盒購自武漢塞維爾生物，貨號分別為：G1003、GB13028及GB11188；SOD檢測試劑盒均購自南京建成生物，貨號為A001；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）及TGF-β、TNF-α檢測所需試劑盒購自江蘇酶免。Precise1120直線加速器購自瑞典醫科達公司，酶標儀購自BIO-RAD公司。

1.2 動物分組與造模

將54只健康C57BL/6小鼠隨機分為空白組、DHA組、單純照射模型（IR）組，每組18只。對IR組小鼠進行RILI造模，小鼠RILI的造模于廣西醫科大學附屬腫瘤醫院的放療中心進行，照射方法為單次全肺20 Gy劑量照射，此為課題組前期實驗已證實可以造模成功的方法[9]：使用1%戊巴比妥鈉（劑量為45 mg/kg）將小鼠麻醉，注射方式為腹腔注射，擺位后進行CT模擬定位，勾畫照射野為全肺，照射面積約為1 cm×12 cm，每次照射6只小鼠，并排放置在照射臺上，間隔為2 cm，用直線加速器進行單次雙肺照射，照射劑量20 Gy，放射參數6 MV光子，皮源距100 cm，照射野30 cm×0.6 cm。空白組麻醉后佯裝照射。照射結束后將小鼠送回動物實驗中心飼養，并分別于照射后7 d、14 d處死小鼠。

1.3 給藥方式與劑量

DHA溶于羧甲基纖維素鈉（CMCNA）溶液中，各組均于照射前1 d開始給藥，每日1次灌胃給藥，連續7 d，DHA組按照前期預實驗結果確定的25 mg/kg·d-1的劑量給藥；空白組和IR組給予等量生理鹽水。

1.4 小鼠肺標本的收集及處理

分別于照射后7 d、14 d兩個時間點，每組各隨機取9只小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠后，打開胸腔，取出雙側新鮮肺組織，將左、右兩側肺均分為2份，左肺置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于觀察病理改變，取右肺置于凍存管中，放入-80℃冰箱中保存待檢測。

1.5 方法

1.5.1 HE染色觀察肺組織病理改變 取處理好的左側小鼠肺組織標本，石蠟包埋，5μm連續切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織炎性病理變化，并采用Szapiel半定量法[10]對其進行評分，1分：無肺泡炎表現；2分：輕度肺泡炎表現，即受累面積＜20%肺葉；3分：中度肺泡炎，即受累面積為20%～50%肺葉；4分：重度肺泡炎，即受累面積＞50%肺葉。

1.5.2 免疫組化染色觀察TNF-α和TGF-β表達 取處理好的左側小鼠肺組織標本，石蠟包埋，5μm連續切片，根據試劑盒說明書步驟，采用免疫組化法對肺組織中TNF-α和TGF-β蛋白相對表達量進行檢測，免疫組化染色評分（IRS）＝染色強度（SI）×陽性細胞百分比（PP）[11]。SI不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。PP評分為：視野中未見陽性細胞為0分，陽性細胞占總細胞數＜10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分。

1.5.3 冰凍切片DHE染色觀察ROS陽性細胞 取處理好的左側小鼠肺組織標本，在自制的錫箔紙小杯中以OCT包埋，液氮速凍15 s后存于-80℃冰箱，行厚度為8μm的冰凍切片。每張切片滴加50μL的10μmol/L DHE工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗后，滴加抗熒光猝滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 電鏡觀察線粒體超微結構 將肺組織制成約1 mm×1 mm×1 mm的組織小塊，經電鏡固定液迅速固定30 min，使用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色法染色，應用透射電鏡觀察肺組織細胞線粒體超微結構的變化。

1.5.5 ELISA檢測TNF-α和TGF-β的濃度 取各組小鼠相同部位肺組織，制作肺勻漿，3 000 r/min離心15 min，取其上清液用于檢測，實驗過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.6 BCA法檢測總蛋白含量 制作各組小鼠肺勻漿，取其上清液用于檢測，其余按試劑盒說明書操作。

1.5.7 羥胺法檢測肺組織SOD含量 制作各組小鼠肺勻漿，取其上清液用于檢測，按SOD試劑盒說明書，采用多功能酶標儀檢測肺組織SOD活性（波長550 nm）。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織HE染色及肺組織總蛋白含量比較

小鼠肺組織HE染色結果顯示：空白組小鼠肺組織肺泡壁薄、結構清晰。照射7 d和14 d后，IR組與DHA組小鼠均出現不同程度局灶性肺泡壁水腫、肺泡間隔增厚（圖1白色箭頭所示），巨噬細胞、中性粒細胞浸潤、局部肺泡內充血（圖1黑色箭頭所示），其中IR組肺組織炎癥明顯加重，而DHA組則反應較輕；照射7 d和14 d后各組小鼠肺組織病理評分結果中，IR組評分較空白組升高，DHA組較IR組降低（均P＜0.05）；肺勻漿BCA法總蛋白含量檢測結果顯示，照射后7 d，各組小鼠肺組織總蛋白含量比較，未呈現明顯差異（P＞0.05）；照射后14 d，IR組總蛋白含量較空白組升高，DHA組較IR組降低（均P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠肺組織病理評分及總蛋白含量比較 ，n＝9

表1 各組小鼠肺組織病理評分及總蛋白含量比較 ，n＝9

與空白組比較，a P＜0.05；與IR組比較，b P＜0.05。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色圖（×200）

2.2 各組小鼠肺組織TNF-α和TGF-β蛋白表達比較

免疫組化染色結果顯示：空白組和DHA組小鼠肺組織支氣管上皮中可見TNF-α和TGF-β呈散在表達，在肺實質中有少量炎癥細胞及肺泡上皮細胞呈弱陽性（淡黃色）表達；照射后7 d和14 d，IR組肺組織TNF-α和TGF-β表達均增加，主要在支氣管上皮中表達，呈片狀、強陽性（棕褐色）表達，見圖2、圖3（TNF-α和TGF-β陽性表達如白色箭頭所示）。

圖2 各組小鼠肺組織病理TGF-β免疫組化染色結果比較（×400）

圖3 各組小鼠肺組織病理TNF-α免疫組化染色結果比較（×400）

照射后7 d、14 d，與空白組比較，IR組肺組織TGF-β和TNF-α的IRS評分升高（P＜0.05），與IR組比較，DHA組肺組織TGF-β和TNF-α的IRS評分降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠肺組織TGF-β和TNF-α的IRS評分比較 ，n＝9

表2 各組小鼠肺組織TGF-β和TNF-α的IRS評分比較 ，n＝9

與空白組比較，a P＜0.05；與IR組比較，b P＜0.05。

2.3 各組小鼠肺組織TGF-β、TNF-α含量及SOD活性比較

照射后7 d、14 d，與空白組比較，IR組肺組織中TGF-β和TNF-α含量均明顯增高（P＜0.05），與IR組比較，DHA組肺組織中TGF-β和TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）；照射后7 d，各組SOD活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；照射后14 d，與空白組比較，IR組SOD活性降低（P＜0.05），DHA組SOD活性高于IR組（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠肺組織TGF-β、TNF-α含量及SOD活性比較 ，n＝9

表3 各組小鼠肺組織TGF-β、TNF-α含量及SOD活性比較 ，n＝9

與空白組比較，a P＜0.05；與IR組比較，b P＜0.05。

2.4 各組小鼠肺組織細胞線粒體形態比較

照射后14 d，各組小鼠肺組織細胞線粒體形態學透射電鏡下觀察顯示：空白組小鼠肺組織細胞線粒體結構基本正常；與空白組比較，IR組小鼠肺細胞超微結構明顯受損，線粒體明顯腫脹、嵴數量明顯減少或消失，嗜鋨性板層小體的板層結構出現明顯融合或消失；與IR組比較，DHA組小鼠肺組織細胞超微結構損傷程度有所減輕，見圖4（線粒體結構改變見圖中白色箭頭所示）。

圖4 各組小鼠肺組織細胞線粒體形態

2.5 各組小鼠肺組織ROS水平比較

照射后14 d，各組肺組織冰凍切片DHE-ROS染色結果顯示：肺組織細胞中ROS呈現紅染，IR組小鼠肺組織切片中ROS陽性表達細胞較空白組增多；與IR組相比，DHA組小鼠肺組織切片中ROS陽性表達細胞減少，見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織DHE-ROS染色圖（×400）

3 討論

RILI是一種由機體免疫系統介導的局部放射反應，其病理過程并不是單一靶細胞損傷的結果，而是具有多種細胞因子調控和多種細胞參與的復雜過程。有研究顯示，TGF-β、TNF-α能趨化巨噬細胞和相關炎癥細胞，誘導其合成IL-1、IL-6等細胞因子逐層放大“炎癥瀑布”效應，進一步加劇肺部炎癥反應及氧化應激[12-13]。有研究顯示，青蒿素可明顯抑制CpG DNA誘導的TNF-α和TGF-β釋放，并且青蒿素可顯著減少膿毒癥大鼠炎癥介質TNF-α和TGF-β的釋放[14]。同時，DHA能夠明顯改善RILI小鼠肺組織的炎性滲出，抑制膠原纖維的產生，對RILI有保護作用[15]。本實驗對TGF-β和TNF-α兩種細胞炎性因子進行測定，進一步研究DHA對小鼠RILI的干預作用。組織病理學實驗結果顯示，IR組小鼠肺泡炎評分和免疫組化評分明顯升高，肺組織TNF-α和TGF-β含量明顯增加，DHA組小鼠肺泡炎評分和免疫組化評分降低，肺組織TNF-α和TGF-β含量有所減少，同時，ELISA實驗結果同樣呈現以上趨勢，揭示DHA可以抑制小鼠肺部TGF-β和TNF-α的表達，DHA可能通過減少細胞炎性因子來減輕RILI。

近年來大量研究表明，氧化應激也是造成RILI的重要機制之一[16]。較高劑量射線進入肺組織時，將通過與機體水分子發生離子化反應產生大量ROS，ROS可對DNA、蛋白質及脂膜造成破壞，從而誘導氧化應激,上調TGF-β，并能使線粒體等細胞器功能損壞[7,17]，進一步引發RILI進展。SOD是機體最主要的自由基清除劑，其可通過催化超氧陰離子和過氧化氫發生歧化反應而減少活性氧含量[18-19]。本實驗中，IR組小鼠肺組織照射后14 d SOD活性降低，肺細胞線粒體超微結構損傷明顯，肺組織ROS陽性細胞表達增加，而DHA組小鼠肺組織SOD活性明顯升高，肺細胞線粒體超微結構損傷減輕，肺組織ROS陽性細胞表達減少。提示DHA可保護肺組織中SOD活性，減輕線粒體超微結構損傷，減少肺組織ROS的產生，緩解氧化應激反應，且其作用于該模型的時間為用藥后7 d。

本文初步探討了DHA對放療誘導的肺損傷的作用及其機制，旨在為臨床治療RILI提供新的可能，DHA有望成為臨床治療RILI的候選藥物，但DHA對RILI的保護作用機制還有待進一步研究。