流式細胞術監測免疫抑制后樹鼩外周血淋巴細胞的動態變化*

江 惠，賴永靜，李 驊，馮一唯，夏 巍，唐安洲

（廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科 廣西醫科大學區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，南寧 530021）

樹鼩是一種小型哺乳動物，隸屬攀鼩目，主要分布于馬來西亞、菲律賓，我國云南、廣西等地區[1]。樹鼩與靈長類親緣關系較近[2]，并且具有繁殖周期短、飼養成本低的特點，因此被用于人類疾病的預防和治療研究，國內外學者已建立多種疾病樹鼩模型[3-11]。然而，相比大鼠、小鼠等成熟的模型動物，目前樹鼩特異性抗體等實驗試劑的開發尚不充分，影響對諸如樹鼩免疫系統特性等方面的研究。流式細胞術是一種通過流式細胞儀快速定量分析細胞群的物理化學特征，并根據這些特征精確分選細胞的技術，通過加入特異性抗體可將細胞群進一步細分，如將外周血淋巴細胞分為CD3、CD4、CD8等，可用于免疫學[12-14]、細胞和分子生物學等方面研究[15]。建立和開發樹鼩特異性抗體是一項投入較大的基礎工程，需要進行系統研究，逐步開發完善。近年有學者通過篩選其他物種來源（小鼠、兔等）的熒光抗體，根據抗原抗體交叉反應的特性，進行樹鼩細胞表型分析，結果表明小鼠的相應抗體具有相對特異性和敏感性[16-18]。使用跨物種抗體具有價格低、獲取方便等優勢，可為建立樹鼩淋巴細胞分析和數量變化方法提供快捷路徑。

環孢素A（cyclosporine A，CsA）是由真菌代謝產物中提取得到的由11個氨基酸組成的環狀多肽，可選擇性抑制T細胞活化[19]，對B細胞的抑制作用弱，可部分抑制T細胞依賴的B細胞反應，常用于抑制淋巴細胞。本研究主要應用流式細胞術，探索建立一種適用于樹鼩外周血淋巴細胞的檢測方法，并且利用該方法動態觀察注射CsA樹鼩的淋巴細胞、CD4+、CD19+細胞百分比的變化，為樹鼩動物模型的建立及人類免疫缺陷相關疾病的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年樹鼩18只，體重110～160 g，購自昆明醫科大學實驗動物中心，為人工繁育的普通級中緬樹鼩滇西亞種，飼養于廣西醫科大學實驗動物中心，采用金屬籠具單籠飼養，內置休息木盒，室溫22～25℃，濕度40%～60%，每日光照12～14 h，保持籠具、食具清潔衛生，定時喂食谷物、面包蟲、水果等，自由飲水，室內保持安靜。實驗過程中樹鼩的飼養和實驗操作均符合廣西醫科大學動物實驗倫理委員會相關規定。

1.2 主要試劑及儀器 PBS（Solarbio，北京）、FITC倉鼠抗小鼠CD3（BD，美國）、APC大鼠抗小鼠CD4（BD，美國）、APC抗鼠CD19（Biolegend，美國）、牛血清白蛋白（BSA，BioFroxx，德國）、紅細胞裂解液（Solarbio，北京）、臺盼藍染色液（Sigma、美國）。流式細胞儀（BD FACSVerse，美國）、臺式高速低溫離心機（Eppendorf 5810R，德國）、光學顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 實驗分組及處理 將18只樹鼩隨機分為空白組（10只）、CsA高劑量組（4只）和CsA低劑量組（4只）。空白組不予處理。CsA高、低劑量組分別經腹腔注射20 mg/kg和40 mg/kg的CsA，連續注射35 d，1次/d。采血當日不注射。

1.4 血樣采集 分別在第1、第7天，抽取空白組股靜脈血1 mL（比較不同時間淋巴細胞及各亞群差異，以檢驗流式實驗操作的穩定性）。分別在第0（注射CsA前1 d）、第7、第13、第20、第29、第35天，抽取CsA高、低劑量組股靜脈血1 mL。采血前12 h禁食，將動物固定于保定裝置，采血后迅速放入含有EDTA抗凝劑的采血管中，輕輕搖晃混勻，室溫放置。

1.5 樹鼩外周血單細胞懸液的制備 采集的血液加入3倍體積紅細胞裂解液，冰上裂解15 min；4℃離心10 min（2 000 r/min），棄上清液，加入2倍體積裂解液，吹打混勻，動作輕柔，再次4℃離心10 min（2 000 r/min）；小心吸棄上清液，用染色緩沖液重懸，即得外周血單細胞懸液，將細胞密度調整為1×106個/mL，置于冰上避光備用。

1.6 臺盼藍染色法檢測兩種不同染色緩沖液對細胞存活率的影響 取空白組外周血單細胞懸液10μL（之前分別用兩種不同染色緩沖液：1×PBS溶液、含1%BSA的1×PBS溶液重懸），加入10μL臺盼藍進行染色，顯微鏡下觀察、拍照，計算細胞存活率。細胞存活率=活細胞數量/總細胞數量。死細胞被染成藍色。

1.7 流式細胞術檢測樹鼩外周血淋巴細胞表面分子 將樹鼩外周血單細胞懸液分裝到無菌無酶的潔凈1.5 mL EP管中，每管100μL；避光加入1μL流式熒光抗體，輕輕搖晃混勻，4℃避光孵育30 min；加入1 mL染色緩沖液，輕輕搖晃混勻；1 300 r/min離心5 min，小心吸棄上清液；加入200μL染色緩沖液重懸，流式細胞儀檢測樹鼩外周血淋巴細胞及其亞群（CD3+、CD4+、CD19+）。將CsA高、低劑量組的第0天結果（淋巴細胞及亞群百分率）均設為100%，計算第7、第13、第20、第29、第35天結果與第0天結果的比值。

1.8 統計學方法 使用flowjo（10.6.2）軟件分析流式數據。采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樹鼩外周血模型 SSC為側向散射光，表示細胞內容物的復雜度，FSC為前向散射光，表示細胞體積的大小。樹鼩外周血與靈長類動物結果相似，顯示樹鼩外周血可清晰地分為4群，分別為細胞體積較大、胞內容物較豐富的粒細胞（a），中等大小的髓樣細胞（b），體積較小的淋巴細胞（c）以及小顆粒（紅細胞、血小板和碎片，d），見圖1。

圖1 樹鼩外周血FSC/SSC模式圖

2.2 不同染色緩沖液對細胞存活率的影響 用含1%BSA的PBS作為染色緩沖液重懸的細胞存活率高于用PBS重懸的細胞（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同染色緩沖液對細胞活率的影響

2.3 空白組不同采血時間的外周血淋巴細胞及其亞群百分率比較 空白組不同采血時間的外周血淋巴細胞、CD3+、CD4+、CD19+百分率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。CD3+細胞百分率的檢測結果標準差過大，因此該實驗結果不可信，見圖3。

圖3 空白組不同采血時間的外周血淋巴細胞及其亞群百分率比較

2.4 動態監測注射CsA樹鼩淋巴細胞及亞群百分率變化 由于前述結果顯示實驗中所使用的CD3抗體并不適用于檢測樹鼩CD3+細胞，故僅對注射低劑量和高劑量CsA樹鼩的淋巴細胞、CD4+、CD19+細胞進行動態觀察（35 d）。

CsA高、低劑量組淋巴細胞在注射前兩周下降，在第3、第4周有所上升，第5周下降；兩組CD4+細胞在第1周有輕微上升趨勢，第2周明顯下降，之后呈先升高再下降的趨勢；CsA低劑量組CD19+細胞在前3周先下降后上升，隨后持續下降，而高劑量組在整個觀察期內呈持續下降趨勢，見圖4。

圖4 注射CsA后樹鼩外周血淋巴細胞、CD4+和CD19+細胞百分率的變化

3 討論

本研究建立了一種應用流式細胞術檢測樹鼩的外周血淋巴細胞的方法，FSC/SSC模式圖顯示所制備的樹鼩外周血淋巴細胞樣本分群良好、細胞碎片少。在PBS中加入1%BSA后，提高了裂解后的細胞存活率，細胞狀態對于流式分析上機的結果影響較大，存活率高的單細胞懸液能夠盡可能地排除實驗的誤差，得到更準確、可靠的實驗數據，同時也為流式細胞分選實驗打下了基礎，狀態良好的細胞有利于分選實驗后的細胞培養與功能檢測相關實驗。

使用相同的紅細胞裂解以及樣本染色實驗流程分別在第1天和第7天檢測空白組樹鼩外周血淋巴細胞、CD3+細胞、CD4+細胞和CD9+細胞的百分比，以探究實驗操作的穩定性，同時評估跨物種流式抗體應用于樹鼩外周血淋巴細胞樣本的可行性，實驗結果表明不同時間淋巴細胞、CD4+細胞、CD19+細胞百分率均無明顯差異，可認為本實驗建立的流式細胞實驗方法穩定、可靠。由于CD3為T細胞廣譜的表面分子，本實驗中使用的CD3抗體與細胞表面結合后檢測得出的百分比相對較低，并且標準差較大，說明抗體與細胞結合不夠穩定，即該抗體不適用于檢測樹鼩外周血CD3+細胞免疫表型。因此，對于已經篩選出的跨物種抗體，如要用于樹鼩研究，應進一步驗證實驗穩定性。

此外，本研究結果顯示，注射CsA樹鼩的淋巴細胞、CD4+、CD19+細胞總體呈下降趨勢，與CsA藥理學作用相符，證明CsA對樹鼩有免疫抑制效果，可用于制備免疫抑制狀態的樹鼩模型。目前已有樹鼩免疫細胞表面分子相關研究，并且學者們也相繼進行樹鼩特異性抗體制備的探索[20-24]，相信未來針對樹鼩的研究工具，包括其專用的試劑、適合樹鼩的實驗方法等將逐漸完善。然而，目前難以通過流式細胞學方法精確分析樹鼩免疫細胞表型，今后將進一步探索樹鼩模型，制備樹鼩特異性抗體，更好地利用流式細胞術分析樹鼩免疫系統特性，完善樹鼩作為免疫相關疾病動物模型的建立。

綜上，本研究在缺乏樹鼩特異性抗體的情況下，建立了適用于樹鼩外周血樣本檢測的流式細胞學方法，利用抗體的交叉反應性篩選了適合用于分析樹鼩外周血CD4+和CD19+細胞的抗體，觀察到樹鼩在免疫抑制狀態下外周血淋巴細胞、CD4+以及CD19+細胞的變化趨勢，為進一步研究樹鼩的T、B淋巴細胞對感染的反應以及其對疾病發生、發展的作用打下基礎。