沙庫巴曲纈沙坦對慢性心力衰竭小鼠心功能的影響及作用機制*

莫壁伶，余市成，鐘惠娟，林海真，周治來

（1.廣州市荔灣中心醫院，廣州 510130；2.廣東省第二人民醫院，廣州 510137）

慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是大多數心血管疾病的終末表現，嚴重威脅我國人民生命健康。心力衰竭可引起一系列的神經體液變化，主要是交感神經興奮性增強，腎素血管緊張素醛固酮系統（RAAS）激活[1]。眾所周知，沙庫巴曲纈沙坦可同時作用于腦啡肽酶（neprilysin,NEP）和腎素－血管緊張素雙系統，起到排鈉利尿、擴張血管以及預防和逆轉心室重構的作用，是治療CHF的新藥[2-3]。但除以上兩個主要神經體液調節機制，心肌炎癥和凋亡也是介導心臟重塑的重要因素[4]，目前關于沙庫巴曲纈沙坦對CHF炎癥、凋亡的調控作用及機制仍未闡明。本研究通過構建小鼠CHF模型，給予沙庫巴曲纈沙坦治療，探討其對炎癥、凋亡的調控作用及其對心功能的影響，進一步闡明沙庫巴曲纈沙坦對CHF心肌的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8周齡SPF級C57/BL6雌性小鼠30只,購自廣東省醫學實驗動物中心［SCXK（粵）2018-0002］,體重（25±2）g。飼養期間自由進食及飲水。本研究符合動物倫理相關規定。

1.1.2 實驗試劑及儀器 沙庫巴曲纈沙坦（諾欣妥，國藥準字：H20170344，50 mg/片，Novartis公司），阿霉素（sigma），兔抗小鼠CD68單克隆抗體（BIO-RAD），兔抗小鼠Active Caspase-3單克隆抗體（Cell Signal Technology）。小動物心臟超聲儀（Vevo 3100 Imaging System），倒置顯微鏡（型號DMI1，Leica），熒光顯微鏡（型號TCSSP2，Leica）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型制備 將30只小鼠按隨機數字表法隨機分成空白組、模型組和治療組，每組10只。模型組和治療組采用腹腔注射阿霉素制備慢性充血性心力衰竭小鼠模型。具體方法：滅菌注射用水溶解阿霉素粉針，配成0.8 mg/mL濃度，按1.5 mg/kg的劑量每3 d一次進行腹腔注射，連續給藥6周，期間空白組小鼠予以等量生理鹽水。

1.2.2 藥物治療方案 造模成功后開始藥物治療，治療時間為4周。治療組小鼠灌胃沙庫巴曲纈沙坦（68 mg/kg），空白組和模型組小鼠予以等量生理鹽水。

1.2.3 心臟超聲檢查 在治療結束后，采用超聲心動圖（vevo 3100 imaging system）對小鼠進行高頻超聲心動圖檢查。具體方法：小鼠吸入異氟烷氣體進行麻醉,探頭切跡朝向小鼠頭部,觀察小鼠心臟運動情況,啟動分析測試系統，記錄檢測的參數包括左心室射血分數（LVEF）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.2.4 Bio-Plex懸液芯片技術檢測各組小鼠靜脈血炎癥因子濃度 治療結束后，收集小鼠尾靜脈血0.5 mL，離心后取上清，-80℃凍存備用。待所有標本收集完畢，4℃水浴解凍，使用Bio-Plex細胞因子檢測試劑盒檢測12種細胞因子。按說明書操作：用250μL標準品稀釋液溶解標準品凍干粉，并制備連續4倍稀釋的系列標準品；在96孔板的每個孔分別加入標準品、稀釋液、待測品，隨后每孔加入50μL磁性微球。樣本孵育完成后，使用Bio-Plex磁力架手動洗板3次除去殘留液，將檢測抗體加入96孔反應板，25μL/孔?？贵w孵育完成后，去除殘留液，每孔加入50μL Streptavidin-PE（SA-PE），室溫搖床孵育10 min。孵育完成后洗板，加入Assay buffer重懸孔內微球，125μL/孔。室溫搖床重懸2 min。運行Bio-Plex 200懸液芯片系統儀器，上機檢測。使用Bio-Plex Manager 6.1軟件讀取并分析數據。

1.2.5 蘇木精—伊紅（HE）染色及免疫熒光檢測治療結束后，過量麻醉處死動物并快速取出心臟，從3組中各隨機挑選5個心臟標本，用4%多聚甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋、4μm厚切片，按標準行HE染色，光學顯微鏡下觀察3組小鼠心肌纖維、心肌細胞排列等情況。石蠟切片常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，檸檬酸鈉緩沖液（pH=6.0）修復高溫修復5 min，PBS漂洗5 min×3次，山羊血清封閉30 min后加入一抗：兔抗小鼠CD68（1:200）檢測炎癥細胞浸潤情況，兔抗小鼠Active Caspase-3（1∶400）檢測心肌凋亡情況。4℃孵育過夜，PBS漂洗5 min×3次，加入二抗Alexa Fluor 594山羊抗兔（1∶500），室溫孵育30 min。DAPI復染后封片，Leica熒光顯微鏡下觀察，采用Image J軟件分析圖片。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 沙庫巴曲纈沙坦對心力衰竭小鼠炎癥的調節作用

與空白組比較，模型組中6種細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-8）顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17顯著下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清中細胞因子表達情況 pg/mL，，n=5

表1 各組小鼠血清中細胞因子表達情況 pg/mL，，n=5

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 心臟超聲結果

模型組小鼠心室壁菲薄，室壁運動紊亂，治療組小鼠LVEF、LVFS顯著高于模型組，LVESD、LVEDD顯著小于模型組（P＜0.05)，見表2、圖1。

圖1 3組小鼠心臟彩超圖像

表2 各組小鼠超聲參數變化 ，n=5

表2 各組小鼠超聲參數變化 ，n=5

與空白組比較,*P＜0.05，與模型組比較,#P＜0.05。

2.3 沙庫巴曲纈沙坦對CHF小鼠心肌病理的作用

HE染色顯示，空白組小鼠心肌細胞排列規則，細胞間隙均勻，細胞核偏小、排列疏松，心肌橫紋清晰；模型組小鼠心肌細胞排列紊亂，細胞增大、擁擠，細胞間隙不清，細胞核增大，核型不規則，可見畸形核，細胞核排列紊亂，細胞質染色不均、團塊狀，心肌橫紋結構不清；治療組小鼠心肌細胞排列規則，細胞輕度增大，細胞間隙尚均勻，細胞核排列尚規則，心肌橫紋較清晰。免疫熒光染色顯示，空白組小鼠可見散在分布少量CD68陽性巨噬細胞，模型組可見大量CD68陽性細胞，而治療組CD68陽性細胞數量與模型組相比顯著下降（P＜0.05）；在空白組中，Caspase-3陽性表達很低，治療組Caspase-3陽性細胞數量顯著少于模型組(P＜0.05），見表3、圖2。

圖2 各組小鼠心肌HE染色（A，×400）、CD68陽性細胞（B,×200）和Caspase-3陽性細胞染色（C,×200）的情況（標尺：100μm）

表3 各組小鼠心肌切片CD68陽性面積百分比和Caspase-3陽性細胞數 ,n=5

表3 各組小鼠心肌切片CD68陽性面積百分比和Caspase-3陽性細胞數 ,n=5

與空白組比較,*P＜0.05，與模型組比較,#P＜0.05。

3 討論

CHF可活體內交感神經興奮性、激活腎素—血管緊張素醛固酮系統等，導致心肌細胞損傷及重塑[5]。目前認為沙庫巴曲纈沙坦作用于腦啡肽酶和腎素—血管緊張素雙系統，起到排鈉利尿、擴張血管以逆轉心室重構的作用，但其對心力衰竭后炎癥和凋亡的調控及其在修復心肌中的作用尚未完全闡明。本研究通過構建CHF小鼠模型，予以沙庫巴曲纈沙坦治療，發現其顯著下調心力衰竭小鼠促炎因子表達水平，抑制心肌炎癥細胞浸潤，減輕心肌細胞凋亡，改善心肌重構和增強小鼠心功能。

炎癥與心力衰竭的發生發展密切相關[6]。沙庫巴曲纈沙坦對CHF炎癥調控作用尚未完全闡明。張相杰等[7]指出，沙庫巴曲纈沙坦能降低心力衰竭患者血清中IL-33、TNF-α和ICAM1表達水平，改善患者心室重塑，改善心功能。張瑞英等[8]證實，沙庫巴曲纈沙坦可以降低急性心?；颊哐蠭L-6、TNFα和內皮素1的表達水平，改善PCI治療后的心室重構。國外有研究指出，沙庫巴曲纈沙坦可以顯著抑制CHF伴射血分數下降患者TNF-α和IL-18的濃度，改善外周血管功能和心功能[9]。以上研究提示，抑制心力衰竭患者體內炎癥因子可能是沙庫巴曲纈沙坦治療心力衰竭的機制之一。但這些研究僅僅采用ELISA法檢測了少數幾種炎癥因子。由于心力衰竭會激活體內炎癥網絡，導致大量炎癥因子表達變化，本研究采用Bio-Plex懸液芯片技術檢測12種細胞因子，與傳統的ELISA方法相比，具有可同時檢測多種細胞因子、高敏感性、高精確性的特點，可顯著提升一次檢測獲取單個樣本信息的能力[10-11]。結果顯示，與空白組相比，6種炎癥因子在模型組表達升高，但沙庫巴曲纈沙坦可顯著下調其中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17的濃度。這些細胞因子濃度異常升高，可激活機體防御反應、免疫細胞增殖、分化等，導致全身炎癥反應。尤其是IL-6，與受體IL-6R結合后形成IL-6/IL-6R復合物，該復合物進一步激活gp130，在心血管系統主要表現為增加血小板數量，增強單核細胞促凝功能，加劇動脈粥樣硬化，加重心肌損傷[12]。本研究發現，沙庫巴曲纈沙坦治療組IL-6濃度下降幅度大，提示沙庫巴曲纈沙坦的治療作用強。IL-1β、TNF-α與IL-6的作用類似，均對心肌有毒害作用[13]。

IL-17是調節心肌重構的重要因子。IL-17可以濃度依賴性降低心肌細胞鈣離子內流電流幅度，增加炎癥通路NF-κB亞基p50和p65的表達，增強炎癥反應。IL-17能通過調節TGF-β的生存，促進心肌細胞纖維化，并能通過STAT3信號通路激活Th17細胞分化，加重心肌纖維化[14]。本研究結果顯示，沙庫巴曲纈沙坦能顯著下調CHF小鼠血清IL-17濃度，這可能是其治療CHF的一個重要機制。但關于IL-10對心肌的作用尚存爭議，其即可通過激活巨噬細胞而間接發揮加重纖維化的作用，影響心臟舒張功能。也有研究認為，IL-10等抗炎因子對纖維化作用不明顯，基因敲除IL-10并不影響模型動物肌纖維細胞增殖和心肌重塑[15]。本研究發現，與模型組比較，治療組IL-4、IL-10等抗炎因子濃度比較，差異無統計學意義。推測IL-4和IL-10的具體作用與具體環境有關，關于IL-4、IL-10在沙庫巴曲纈沙坦治療CHF中的具體作用仍需進一步研究。

阿霉素具有較強的心臟毒性，通過長期、反復腹腔注射阿霉素可誘導充血性心力衰竭模型，該操作方法簡單、創傷小且重復率高，是一種公認的可用于制作充血性心力衰竭[16]。心臟結構和功能的改變是本研究的重要監測指標，為準確評估沙庫巴曲纈沙坦對CHF小鼠心功能的改善作用，本研究在治療結束時采用高頻心臟超聲檢測所有動物LVEF、LVESD、LVEDD和LVFS，以全面反映各組小鼠心臟功能變化。結果顯示，沙庫巴曲纈沙坦能顯著改善心力衰竭小鼠LVEF、LVESD、LVFS和LVEDD，說明沙庫巴曲纈沙坦治療4周可以顯著改善CHF小鼠心肌收縮功能，這與既往研究結果類似[17]。心肌結構與心功能關系密切，長期的血流動力學改變導致心肌重構，包括心肌細胞肥大，心肌纖維增多，最終導致心肌細胞凋亡、壞死，心功能不可逆損傷[18]。本研究的HE染色結果顯示，治療組小鼠心肌細胞結構顯著優于模型組，免疫熒光進一步證實，治療組Caspase-3陽性凋亡細胞、CD68陽性炎癥細胞數量顯著少于模型組，證實沙庫巴曲纈沙坦治療可以降低CHF小鼠心肌細胞炎癥和凋亡反應，改善心肌重構。

綜上所述，沙庫巴曲纈沙坦可以緩解CHF小鼠心肌炎癥細胞浸潤和細胞凋亡，改善心室重塑，增強心功能，其機制可能與其下調促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17等的表達有關。