廣西三江縣侗族與漢族新生兒UGT1A1基因多態性分析*

姚 璇，鐘丹妮Δ，彭運聰

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院兒科，南寧 530021；2.三江侗族自治縣人民醫院兒科，柳州 545500）

已有研究證實，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶-A1（uridine diphosphate-glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1）是膽紅素在肝臟進行葡萄糖醛酸化代謝的唯一關鍵酶[1]。若UGT1A1基因發生突變，導致相應酶活性降低，則膽紅素代謝過程受阻，膽紅素積聚從而發生黃疸。國內外研究發現，UGT1A1基因多態性在不同種族人群中分布不同[2-5]。廣西三江縣是多民族聚居地，本文主要探討三江縣侗族和漢族新生兒UGT1A1基因多態性常見類型及其等位基因頻率的民族差異性及不同突變類型對新生兒血清膽紅素水平的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2021年1～12月在廣西壯族自治區三江侗族自治縣人民醫院出生的侗族新生兒152例，漢族新生兒42例（經兒科醫生詢問確認為三代純系侗族/漢族）。病例納入標準：父母、祖父母及外祖父母均為侗族或漢族的新生兒；排除標準:（1）G-6-PD缺乏；（2）地中海貧血；（3）遺傳性紅細胞增多癥；（4）母嬰血型不合導致的溶血性疾病；（5）先天性膽道閉鎖等已明確可影響膽紅素水平的因素。本研究已取得廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（2021KY-E-286）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取新生兒外周血2 mL，以EDTA抗凝，用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，產物置于－20℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR反應及電泳鑒定 根據課題組前期設計的UGT1A1基因啟動子TATA盒及第1外顯子2對引物：TATA盒+exon1-N1（上游引物5’-AAT GGA TCC TGA GGT TCT GG-3’，下游引物5’-CTG GGTAGC CTCAAA TTC CA-3’），產物長度834 bp；exon1-N2（上游引物5’-TTG TCT GGC TGT TCC CAC TT-3，下游引物5’-TGC CAA AGA CAGACT CAA ACC-3’）產物長度657 bp[6]。PCR體系（總體積50μL）：2×Es Tap Master Mix 25μL，上、下游引物各2μL，DNA模板500 ng，無酶水補充至50μL。PCR反應體系見表1。

表1 PCR反應體系

2%瓊脂糖凝膠用Ⅰ型核酸染料染色，以DNA Marker為分子量參照物，每例PCR產物取5μL，電泳條件為120 V電壓，70 mA電流，運行30 min。

1.2.3 基因測序 經電泳檢測過的所有合格的PCR產物，送上海生工進行正向測序。應用chromas軟件分析測序結果，測序結果比對基因文庫的UGT1A1基因序列，觀察波形，發現有堿基突變點的產物重新進行反向測序，以確保結果真實可靠。

1.3 統計學方法

用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料用率（%）表示，基因頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；采用SHEsis在線分析平臺進行等位基因頻率比較、Hardy-Weinberg平衡檢驗、連鎖不平衡檢驗、單倍型分析[7]，其中HWEP＞0.05表示符合遺傳平衡。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UGT1A1基因測序結果

本研究主要檢測已報道的3種突變類型情況：啟動子區域的（TA）6＞7插入突變、c.211G＞A點突變、c.686C＞A點突變。結果顯示：本研究人群中（TA）6＞7插入突變有28例，c.211G＞A點突變60例，（TA）6＞7插入突變+c.686C＞A復合突變2例。基因測序色譜圖見圖1～圖3。

圖1 UGT1A1啟動子（TA）6＞7位點測序圖

圖2 UGT1A1 c.211G＞A位點測序圖

圖3 UGT1A1 c.686C＞A位點測序圖

2.2 UGT1A1不同突變類型對血清總膽紅素水平的影響

攜帶單一c.211G＞A純合突變的血清總膽紅素高于無突變類型，差異有統計學意義（P＜0.05），而攜帶單一（TA）6＞7雜合、單一c.211G＞A雜合、c.686C＞A雜合+A復合突變的血清總膽紅素分別與無突變類型比較差異，均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 不同UGT1A1基因類型血清總膽紅素水平分析

表2 不同UGT1A1基因類型血清總膽紅素水平分析

a、b、c、d分別與無突變類型比較。

2.3 UGT1A1基因多態性分析

在兩個民族群體中（TA）6＞7突變、c.211G＞A兩種類型的預期值和觀察值吻合度較好（P＞0.05），基因類型分布均符合Hardy-Weinberg平衡；侗、漢兩族間（TA）6/7和c.211G＞A的等位基因頻率相近，差異均無統計學意義（P＞0.05）；因c.686C＞A例數僅2例，本研究對其統計學結果不做分析，見表3。

表3 侗、漢兩族UGT1A1基因多態性分析

2.4 UGT1A1基因連鎖不平衡檢驗和單倍型分析

本研究共5種單倍型，最常見的是單倍型1、2兩種（占所有單倍型的80%以上），兩個民族的單倍型頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。在UGT1A1的3個位點之間觀察到的連鎖不平衡見表4，與單倍型對應的頻率和P值見表5。

表4 連鎖不平衡檢驗

表5 侗、漢民族間單倍型頻率比較

3 討論

群體中的多態現象是指在一個群體中存在由遺傳因素決定的兩種及以上的變異基因類型。在同一基因座上如果有≥2個以上的等位基因，當等位基因頻率≥0.01且攜帶該等位基因的雜合子頻率＞2%，則可認為該基因座具有多態性[8-9]。本研究中的（TA）6＞7突變和c.211G＞A點突變均滿足上述兩個條件，因此可認為（TA）6＞7位點和c.211G＞A位點的基因座均具有多態性。

目前國內研究最多的是c.211G＞A位點，該位點的多態性被認為與國內多個民族新生兒高膽紅素血癥的發生有密切關系[6,10-12]。從研究結果中可以看出c.211G＞A是三江縣新生兒一個高頻突變位點，并且攜帶c.211G＞A純合突變的新生兒血清膽紅素水平顯著高于無突變新生兒，說明c.211G＞A純合突變是引起三江縣新生兒血清膽紅素水平升高的重要的遺傳因素。對于（TA）6＞7位點，國內觀點目前認為（TA）6＞7插入突變雖然并不罕見[13-14]，但并不是我國少數民族的高頻突變位點，且與國內新生兒高膽紅素血癥的發生無明顯相關性[6]。另外該位點更多是在高加索人種中發生突變，例如我國的維吾爾族被認為是高加索人種與蒙古人種的混合血統[15]，則有報道維吾爾族的（TA）6＞7突變頻率顯著高于漢族[2]。本研究結果支持上述觀點，認為（TA）6＞7插入突變并不是三江縣新生兒UGT1A1基因的高頻突變位點，且并不會引起新生兒血清膽紅素明顯升高。而c.686C＞A突變，國內外學者一致認為該突變是個罕見突變類型，發生率較低[16-18]。本研究中只發現2例雜合突變，其中2例均是聯合（TA）6＞7突變的復合型基因突變，發生率低，可認為是三江縣新生兒罕見突變類型。（TA）6＞7突變和c.211G＞A突變經檢驗符合遺傳平衡，但是侗族和漢族之間等位基因頻率差異無統計學意義，考慮是這兩個基因座的多態性并不存在民族性差異，符合遺傳平衡可能是自然環境和遺傳因素共同作用的結果。但是同樣是侗族和漢族，其他地區的（TA）6＞7和c.211G＞A等位基因頻率低于本研究[19]，也進一步證實UGT1A1基因突變可能是存在地區性差異而非民族性差異。

綜上，本文通過總結三江縣侗族和漢族新生兒UGT1A1基因多態性的特點，發現位于第1外顯子的c.211G＞A是三江縣新生兒高頻突變位點，且c.211G＞A純合突變是引起血清膽紅素升高的重要遺傳因素，上述結果對于基因篩查制定方案具有一定的臨床指導作用。