中藥制劑702糖漿薄層色譜鑒別與含量測定*

何佩貞，黃春喜，何成章，蔡丹昭，羅 捷，羅 育△

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部，南寧 530021；2.廣西醫科大學基礎醫學院，南寧 530021）

702糖漿是廣西醫科大學第一附屬醫院生產的院內制劑，由何首烏、雞血藤、鉤藤、夜交藤、生地黃等中藥材提取制成，具有養血安神、清熱除煩等功能，在臨床使用中，療效確切，服用便利，處方工藝簡略等中藥制劑的優勢，患者依從性高。本方中的何首烏具補益肝腎、補益精血、強筋骨、烏須發、化濁降脂等作用，臨床用于抗衰老、提高免疫力、降血脂、保護心血管及抗皮膚脂質過氧化等[1-3]；而雞血藤具有清熱解毒、涼血活血、舒經活絡的作用，并顯示出促進造血功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理活性，臨床上使用率較高[4-6]；另外，鉤藤具有清熱平肝、息風定驚、降壓降血的功效[7-9]。

2017年以來，國家高度重視醫院制劑的研發和使用，并鼓勵研發使用醫院制劑，醫院制劑的大量研發生產，也面臨質量控制等問題，為了更好地控制藥品質量，保證用藥安全，本研究采用薄層色譜層析法（TLC）對醫院制劑702糖漿中的何首烏、雞血藤、鉤藤進行鑒別。何首烏為本方的君藥，其中2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷（簡稱二苯乙烯苷）是本制劑產生療效的重要成分之一，可以作為該制劑質量控制的指標成分[10]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對何首烏中二苯乙烯苷的含量進行測定，為本方制劑的質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20A型島津高效液相色譜儀（日本島津公司），UVG20透射防護蓋紫外分析儀（上海領成生物科技有限公司），超聲清洗機（廣州市科潔盟實驗儀器有限公司）。

1.2 試藥

二苯乙烯苷對照品（中國食品藥品檢定所研究院，批號：110844-201512），何首烏對照藥材（批號：B25786）、雞血藤對照藥材（批號：B26132）、鉤藤對照藥材（批號：B25585）均購于上海源葉生物科技有限公司，702糖漿（由廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部提供，批號：20160428、20170718、20201215），陰性樣品（按處方自制），水為純化水，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 TLC鑒別

1.3.1 何首烏 取20 mL糖漿，加100 mL乙酸乙酯，50℃超聲30 min，取乙酸乙酯液層，旋轉蒸發儀濃縮至約5 mL，蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解作為供試品溶液。取1 g何首烏對照藥材，同法制備其對照藥材溶液。取缺何首烏的陰性樣品，同法制備其陰性對照溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照品溶液各5μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，先用三氯甲烷∶甲醇（7∶3）作為展開劑，層析缸中展開至約2.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷∶甲醇（20∶3）為展開劑，層析缸中展開至約7 cm，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下檢視。

1.3.2 雞血藤 取20 mL糖漿，用乙酸乙酯振搖萃取3次，每次50 mL，將3次萃取得到的乙酸乙酯液合并，在旋轉蒸發儀回收乙酸乙酯至約5 mL，再蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解作為供試品溶液。取2 g雞血藤對照藥材，同法制備其對照藥材溶液。取缺雞血藤的陰性樣品，同法制備其陰性對照溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照品溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷∶甲醇（20∶1）為展開劑，層析缸中展開，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下檢視。

1.3.3 鉤藤 取20 mL糖漿，加4 mL濃氨水，浸泡30 min后，加入40 mL氯仿，水浴加熱回流1 h，取氯仿層，旋轉蒸發儀回收氯仿至約3 mL，再用蒸發皿蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解作為供試品溶液。取2 g鉤藤對照藥材，同法制備其對照藥材溶液。取缺鉤藤的陰性樣品，同法制備其陰性對照溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照品溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇（10∶4∶1）為展開劑，層析缸中展開，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下檢視。

1.4 含量測定

1.4.1 色譜條件 參照中國2020年版藥典四部通則0512中HPLC試驗，使用InertSustain?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈∶水（25∶75)，柱溫為30℃，流速為1 mL/min，檢測波長為320 nm。理論塔板數按何首烏二苯乙烯苷計算，應不低于3×103。

1.4.2 溶液配制 精密稱取11.53 mg二苯乙烯苷對照品，置10 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，搖勻，制得1.153 mg/L對照品儲備液。精密吸取2 mL 702糖漿，置100 mL容量瓶中，加乙醇適量，超聲處理5 min，取出冷卻，加乙醇定容，定量濾紙過濾，取濾液，0.22μm微孔濾膜過濾，收集過濾液，制得供試品溶液（在12 h內使用）。取缺何首烏的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

1.4.3 方法學考察 專屬性試驗：在“1.4.1項”下色譜條件，分別精密吸取何首烏二苯乙烯苷對照品、供試品、陰性對照溶液各20μL，進樣，測定，記錄色譜圖。

線性關系：精密吸取對照品儲備液及將其依次稀釋配成1.014 6μg/mL、2.006 0μg/mL、5.003 9μg/mL、10.007 8μg/mL、14.988 6μg/mL、19.992 5μg/mL、25.019 4μg/mL的標準液，進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸。

精密度、穩定性與重復性：精密量取20μL對照品溶液置于高效液相色譜儀中，平行進樣6次，測得二苯乙烯苷的平均峰面積值；精密吸取同一供試品溶液（批號：20170718），分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進樣，記錄峰面積；精密量取同一批號（批號：20170718）6份樣品，按供試品制備方法制備，進樣，記錄色譜峰面積。

加樣回收率：精密量取3份702糖漿（批號：20170718），每份2 mL，按供試品溶液制備方法制備，每份供試品溶液再平均分成3份，各份分別精確加入25μL、69μL、105μL對照品儲備液，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，進樣，記錄色譜峰面積并測定二苯乙烯苷含量。

1.4.4 樣品二苯乙烯苷含量 分別精密量取3批702糖漿樣品（批號：20160428、20170718、20201215），每份2 mL，進樣，記錄色譜峰面積，通過峰面積從標準曲線上查出對應含量，并利用查出值乘以1 000，然后除以2 000，計算各批樣品中二苯乙烯苷的含量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，樣品批次間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLC鑒別

702糖漿劑中何首烏的TLC鑒別結果顯示，在供試品與對照品方框中對應位置上有兩處顯示淡紅色斑點，陰性對照相應位置上無此斑點，見圖1A。702糖漿中雞血藤的TLC鑒別結果顯示，在供試品與對照品方框中對應位置上有兩處顯示淡紅色斑點，陰性對照相應位置上無此斑點，見圖1B。

702糖漿中鉤藤的TLC鑒別結果顯示，供試品與對照方框中相應位置上有3處顯示淡青色斑點，陰性對照相應位置上沒有相應斑點或不明顯，見圖1C。

圖1 702糖漿的薄層色譜圖

2.2 HPLC方法學考察

2.2.1 專屬性試驗 供試品中二苯乙烯苷色譜峰為保留時間為7.597 min，陽性對照品色譜峰的保留時間為7.615 min，兩者保留時間基本一致，而陰性對照品在相應位置上無色譜峰，見圖2。說明本研究制劑中其他成分對二苯乙烯苷的含量測定無干擾，方法專屬性強。

圖2 HPLC圖

2.2.2 線性關系試驗 以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為：Y=820 63X+1 073（r=0.999 9），據此可知二苯乙烯苷在1.014 6～25.019 0μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，見圖3。表明本法適用于二苯乙烯苷的含量測定。

圖3 HPLC測定二苯乙烯苷含量的標準曲線

2.2.3 精密度試驗 精密量取20μL對照品溶液置于高效液相色譜儀中，平行進樣6次，測得二苯乙烯苷的平均峰面積值為658 048，RSD為0.033%，見表1。表明所用儀器精密度符合要求。

表1 精密度考察結果 n=6

2.2.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號：20170718），分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進樣，記錄峰面積，計算得12 h內二苯乙烯苷的平均峰面積為725 606.1，RSD為0.489 6%，見表2。表明供試品溶液在配制后12 h內穩定性良好。

表2 穩定性考察結果 n=7

2.2.5 重復性試驗 精密量取同一批號（批號：20170718）6份樣品，按供試品制備方法制備，進樣，記錄色譜峰面積。測得二苯乙烯苷的平均峰面積值為368 324，RSD為1.19%，見表3。根據2020年版《藥典》規定HPLC法測定二苯乙烯苷含量的穩定性RSD應小于2%，表明本法的重復性良好。

表3 重復性考察結果 n=6

2.2.6 加樣回收試驗 二苯乙烯苷的平均回收率為99.6%，RSD為1.58%，見表4。表明方法準確度較好。

表4 加樣回收率考察結果 n=6

2.3 樣品含量測定

3批702糖漿樣品（批號：20160428、20170718、20201215）的二苯乙烯苷含量分別為4.771μg/mL、4.722μg/mL、4.642μg/mL，3批樣品中的二苯乙烯苷含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 HPLC法測定702糖漿中二苯乙烯苷含量 n=3

3 討論

3.1 TLC鑒別

702糖漿為純中藥制劑，組分復雜，但療效確切，其中何首烏為君藥，雞血藤、鉤藤為臣藥，這3種藥是保證療效的主要成分，參考2020年版《藥典》及相關文獻[10-14]，經過不斷試驗調整，最終確定薄層色譜條件。對何首烏的鑒別，《藥典》使用的是硅膠H薄層板，因此本研究選擇使用此種薄層板，但是鑒別效果不理想，而在沒有更換薄層板的前提下，通過調整展開劑（三氯甲烷∶甲醇）的濃度進行層析，先用展開劑比例為7∶3進行展開，然后將展開劑的比例調整為20∶3進行展開，得到層次分明、背景干凈的結果，可用于本制劑中何首烏的鑒別；對雞血藤的鑒別，《藥典》使用的展開劑是三氯甲烷∶甲醇，但兩者比例為10∶1，達不到分離效果，因此將展開劑調整為20∶1，使得薄層斑點間分離度得到改善，可用于本制劑中雞血藤的鑒別；對鉤藤的鑒別，最初使用的展開劑是石油醚（60～90℃）∶丙酮（9∶6），紫外檢視下有斑點，但清晰度較差，顯色也非常差，之后調整展開劑為氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇（10∶4∶1），同樣條件下紫外檢視，得到斑點清晰的色譜圖，分離效果較好，陰性對照無干擾，可用于本制劑中鉤藤的鑒別。

3.2 含量測定方法

何首烏為該制劑的君藥，其中二苯乙烯苷為何首烏有效成分之一，因此選用測定二苯乙烯苷含量的方法來反映該制劑的質量。目前，分析二苯乙烯苷的方法很多[15-17]，常用的方法有HPLC法、高效毛細管電泳法、紫外分光光度法、酶化學發光法等，其中紫外分光光度法和高效毛細管電泳法較為復雜，很少使用，酶化學發光法要求高，且昂貴，而HPLC法無需事先分離就可直接用于測定含量[18]，樣品直接稀釋即可測定，且受溶液酸堿度等因素影響較小，考慮到該中藥制劑含有多種復雜組分，單個成分難以提取，因此選擇HPLC法作為本制劑中二苯乙烯苷的含量測定方法。本研究結果表明，不同批次的樣品中二苯乙烯苷的平均含量無明顯差異，2020年版《藥典》規定其含量生首烏不應低于1%，制首烏不應低于0.7%，本研究中3個批次的樣品二苯乙烯苷含量穩定，符合用藥要求，可以保證臨床療效。

3.3 方法評價

TLC法可用于對本制劑中的主要組分進行鑒別，操作簡單、結果直觀；HPLC專屬性強、穩定性高，含量測定準確，適用于中藥制劑的質量控制，這兩種方法的組合可作為中藥制劑702糖漿定性鑒別及含量測定的方法。