羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪沉積的影響

王司原，崔可欣，楊小淦，梁興偉

（廣西大學動物科學技術學院亞熱帶生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

脂肪沉積對畜牧生產的影響十分明顯，皮下脂肪沉積與瘦肉率直接相關[1]，同時，脂肪沉積對畜禽的繁殖性能也有影響[2]。家畜脂肪沉積過度可引起飼料轉化率和經濟效益降低，并造成環境污染。然而，當今脂肪沉積調節途徑及機制并未被全面闡述，仍然是困擾畜牧生產的主要問題。因此，尋求有效的脂肪沉積調節途徑有望提高畜禽生產性能，迎合消費者需求。

影響脂肪沉積的因素是多方面的，如營養因素、遺傳因素、飼養環境等。日糧的能量水平、飼料配方、飼料添加劑的合理使用及限飼手段可以調節脂肪沉積。此外，家畜機體過氧化物酶體增殖物激活受體、脂肪酸結合蛋白基因、解耦聯蛋白、脂蛋白脂酶基因及激素敏感脂酶基因的表達也會影響脂肪沉積[3]。同時，飼養環境管控也是影響脂肪沉積的因素之一，溫度、濕度及光照條件等對家畜的脂肪沉積會產生影響[4]。歸根結底，家畜脂肪沉積源于脂肪代謝、脂肪分解的平衡，脂肪能量代謝活性降低會導致脂質過度積累，造成脂肪沉積。不法分子為追求利益，使用瘦肉精干預脂肪代謝，從而提高瘦肉產量，對消費者的生命安全造成威脅。因此，尋找安全便捷的脂肪沉積調節途徑尤為重要。

羅漢果是廣西地區的特色經濟作物，食藥功能兼備，是我國的優質中藥材，也是當今市場上頗受歡迎的綠色食品添加劑。羅漢果甜苷是其主要活性成分，甜度高、熱量低，生理功能豐富多樣，包括但不限于降血壓、降血糖、消炎抗氧化、調節機體代謝、有益于生殖等[5-8]。越來越多的報道顯示，羅漢果甜苷具有調節脂肪沉積的潛力[9-10]，然而其實現作用的途徑及機制并未被充分報道。

本試驗旨在對羅漢果甜苷調節脂肪沉積的作用途徑進行初步探索，利用模型動物構建脂肪沉積模型，探究羅漢果甜苷發揮作用的可能途徑，為羅漢果甜苷在改善肉質品質中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理方法

選取24只4周齡、雄性健康、體重為15±0.5 g的C57BL/6小鼠作為實驗動物。按飼養標準，在光照周期為12 h、室內溫度為22±2℃、濕度為50%～60%的IVC環境內飼養，自由采食和飲水，進行為期1周的環境適應。于小鼠5周齡時開始試驗，每天上午9∶00對各組小鼠進行給藥處理，對照組和高脂飲食組每天灌胃等劑量的(5μL/g)蒸餾水，羅漢果甜苷處理組每天灌胃600 mg/kg的羅漢果甜苷，所選濃度由預試驗得出。試驗期間每周記錄采食量并稱取體重，調整給藥量，連續處理17周。

1.2 主要試劑

維持鼠糧及高脂日糧均購自Research Diets公司；羅漢果甜苷提取物購自桂林萊茵生物科技股份有限公司（產品型號：羅漢果甜苷V 50%-MOV04，生產批號：MOV04-18022504）；蘇木精伊紅染液購自北京索萊寶公司。

1.3 小鼠身體組成分析

將活體小鼠置于小動物身體成分分析儀中進行無創活體檢測。檢測前使用菜籽油進行儀器校準，校準結束后對每只小鼠稱重。稱重后將小鼠放入機器配套的測定管，在不傷害小鼠的前提下固定，使得小鼠無法輕易活動。輸入小鼠體重數據后，將測定管放入機器開始測量，獲得脂肪含量數據、瘦肉率后將小鼠放回原飼養籠。

1.4 脂肪樣本收集及形態觀察

試驗結束后，對小鼠進行二氧化碳麻醉，收集小鼠的血液、皮下脂肪組織并置于準備好的10%福爾馬林固定液中，剩下的樣本放在-196℃的液氮中，凍存于-80℃冰箱中備用。蘇木精伊紅 （hematoxylin and eosin,H&E）染色按照標準流程執行。

1.5 皮下脂肪轉錄組分析

測序文庫由北京百邁客公司制備，原始下機數據借助廣西大學多功能并行運算平臺完成分析。首先，原始數據經去接頭、去冗余等質控步驟，保留堿基質量 Q＞30的純凈序列（clean reads），采用 STAR 軟件對比到小鼠參考基因組 （GRC_m39,Mus musculus），平均對比率達到95%以上。之后利用Feature_counts軟件進行reads計數，得到的表達量信息采用DESeq2軟件進行基因表達差異分析。提取P＜0.01的基因進行GO及KEGG富集。

1.6 血清LC-MS/MS檢測

取冷凍的血清樣本100μL，并添加3倍體積的甲醇，充分振蕩均勻后進行離心處理，轉移上清液并用氮氣吹干，添加50μL甲醇復溶，離心后取上清液上機檢測。利用 HPLC-MS系統 （Thermo Fisher Scientific,USA），采用非靶向代謝組學方法進行分析。色譜柱采用Accucore C18柱 （2.6μm,50 mm×2.1 mm,Thermo Fisher Scientific,USA）。流動相由含有0.025%甲酸的水和甲醇組成，流速為50μL/min。水/甲醇的梯度程序如下：0 min，60%B；2min，60%B；9 min，100%B；17 min，100%B；18 min，60%B。 流動相流程完畢進行洗滌和重新平衡，總運行時長為25 min。質譜模式下的進樣量為2μL，分別在正離子和負離子模式下掃描。電離參數如下：噴霧電壓為4.2 kV；鞘層氣體（氮氣）為15個任意單位（arb）；輔助氣體和掃氣（氮氣）為1 arb；毛細管電壓為37 V；毛細管溫度為275℃；管鏡為80 V。掃描范圍設置為50～1 200 m/z。下機數據在Compound discoverer 3.1軟件分析（Thermo Fisher Scientific），使用 mzCloud（ddMS2）和ChemSpider進行物質識別定性處理。

1.7 統計學分析

所有數據采用GraphPad Prism 8.0進行分析。兩組間的統計學差異采用t檢驗，超過兩組的統計學差異采用方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠身體成分的影響

如圖1A所示，與對照組相比，高脂飲食造成小鼠卡路里攝入量增加，而羅漢果甜苷處理組與高脂飲食組的卡路里攝入量無顯著差異。各組小鼠初始體重無顯著差異，試驗處理結束后，與對照組相比，高脂飲食顯著增加了小鼠體重（圖1B）、體脂率（圖1C），顯著降低了肌肉率（圖1D）。然而補充羅漢果甜苷均能顯著緩解上述指標變化。

圖1 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠身體成分的影響

2.2 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪沉積的影響

為探究羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪沉積的影響，我們首先對各組小鼠皮下脂肪重量進行稱重（如圖2A所示）。與對照組相比，高脂飲食導致小鼠皮下脂肪重量顯著升高，而經羅漢果甜苷處理，小鼠皮下脂肪重量得到顯著恢復。隨后我們對各組小鼠皮下脂肪組織形態進行H&E染色觀察（如圖2B顯示）。同比對照組，高脂飲食造成小鼠皮下脂肪細胞膨大，同時，脂肪細胞直徑增加（圖2C-D）。以上現象經羅漢果甜苷處理得到顯著改善。

圖2 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪沉積的影響

2.3 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪基因表達的影響

轉錄組測序結果展示各組小鼠皮下脂肪基因表達的情況（如圖3A所示）。主成分分析顯示，各組小鼠皮下脂肪基因表達的聚類模式不盡相同 （圖3B），通過對差異表達基因（DEG）的篩選，同對照組相比，高脂飲食引起1 560個基因表達情況發生顯著改變，經羅漢果甜苷處理，681個基因的表達顯著恢復。對恢復表達的基因進行GO分析，發現這些基因主要富集到脂肪酸代謝通路，包括脂肪酸的β氧化、脂肪酸的生物合成及脂質代謝等通路。KEGG分析結果顯示，恢復的基因主要富集到ppar信號通路及代謝通路等。提示經羅漢果甜苷處理可能對脂肪酸代謝通路起調控作用。

圖3 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪基因表達的影響

2.4 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠血清代謝的影響

為進一步驗證羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠脂肪沉積的影響，本試驗采用LC-MS/MS對各組小鼠血清代謝產物進行了非靶向代謝分析。經定性，筆者發現羅漢果甜苷處理能夠恢復三羧酸循環相關分子及脂肪酸類分子的改變，脂肪酸類代謝分子占據較大比重。同時還發現，羅漢果甜苷處理能夠顯著減輕高脂飲食引起的血清尿酸、花生四烯酸含量的增加，證明羅漢果甜苷具有調節血清代謝的作用。

3 討論

脂肪沉積對畜牧生產的影響顯著，皮下脂肪沉積是影響瘦肉率最主要的因素。采取安全有效的脂肪沉積調節途徑能夠有效提高肉品質，提高畜牧生產效益。事實表明，羅漢果甜苷具有調節機體脂肪沉積的作用[11]，然而其實現途徑及機制并未被完全報道。有研究指出，羅漢果甜苷可以激活肝臟AMPK通路，促進肝臟能量代謝以減輕肝臟脂肪沉積[7,12-13]。此外，羅漢果甜苷處理能夠改善小鼠胰島素敏感性及糖耐量受損，從而減輕高脂飲食造成的小鼠體重增加[14-15]。然而，關于羅漢果甜苷對脂肪沉積的影響途徑尚未見報道。

本試驗結果顯示，高脂飲食造成小鼠體重、體脂的顯著提升，瘦肉率顯著下降，同時高脂飲食造成小鼠皮下脂肪含量顯著增加，脂肪形態改變。但是經羅漢果甜苷處理，上述情況均得到顯著改善。另一方面，高脂飲食造成小鼠皮下脂肪組織基因表達情況改變，部分與脂代謝、脂肪酸合成相關的基因表達改變可經羅漢果甜苷處理恢復正常。此外，羅漢果甜苷可以調節血清代謝，恢復包括尿酸、花生四烯酸等代謝產物的變化。上述結果顯示，羅漢果甜苷對小鼠脂肪沉積具有明顯的調節作用，然而對其深入的作用機制需要驗證。

圖4 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠血清代謝的影響

4 結論

羅漢果甜苷可以減輕高脂飲食造成的小鼠皮下脂肪沉積，其實現途徑可能與調節皮下脂肪轉錄因子表達、調節血清代謝有關。