酶底物法測定水中糞大腸菌群的方法驗證及質(zhì)量控制

陳明月

(安徽中科澄信檢測技術(shù)有限公司，安徽 合肥 230051)

1 引言

糞大腸菌群是指在44.5 ℃下能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的總大腸菌群，主要包括腸桿菌科的埃希氏菌屬和耐熱克雷伯氏菌屬細菌[1]。糞大腸菌群在自然界中分布廣泛，主要來源于人和動物的糞便。由于在自然界中易死亡，糞大腸菌群的存在可以反映比較近期的糞便污染。水中糞大腸菌群含量的多少就可以直接反映水體受糞便污染的情況，進而指示腸道致病菌污染危害人體健康的風險。

目前關(guān)于糞大腸菌群的檢測方法有很多，主要有多管發(fā)酵法、紙片法、濾膜法、酶底物法等。在眾多方法中，酶底物法具有操作簡便、假陽性低、結(jié)果可靠、檢驗周期短等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用[2]，成為糞大腸菌群檢驗的最佳分析方法[3～6]。

2 實驗方法

2.1 實驗原理

參照標準《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168-2020)[7]和《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》(HJ 1001-2018)[8]。

大腸桿菌在44.5 ℃下培養(yǎng)24 h，一部分耐熱的大腸菌群被選擇性的生長出來，這被統(tǒng)稱為糞大腸菌群。該類細菌能培養(yǎng)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase) ，將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯酚(ONP)，從而判斷水樣中糞大腸菌群陽性。

2.2 試劑與儀器

科立得試劑(美國愛德士生物科技股份有限公司)；無菌水(用一定量的純水，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min)；97孔定量盤(有49個大孔，48個小孔)；標準陽性比色盤。

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司YX280/15)；生化培養(yǎng)箱(上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司SPX-250)；程控定量封口機(IDEXX)；紫外燈；移液槍；無菌瓶；一般實驗室常用儀器和設(shè)備。

2.3 分析步驟

本次實驗的高濃度樣品為污水處理廠進水，低濃度樣品為污水處理廠出水。

2.3.1 樣品稀釋

用移液槍取高濃度樣品10 mL加入放到已有90 mL無菌水的三角瓶中，混合均勻后并稀釋10倍，再取稀釋10倍的樣品10 mL加入到同樣有90 mL無菌水的三角瓶中，逐級稀釋，直至稀釋樣品結(jié)果在可測的范圍內(nèi)(避免培養(yǎng)后定量盤大孔小孔顏色都為黃色或都未變色)。

2.3.2 接種

量取100 mL的低濃度樣品或稀釋樣品(高濃度樣品和標準樣品)到無菌瓶中，加入科立得試劑，充分混勻溶解后，全部倒入97孔定量盤中，用手撫平定量盤背面，趕走孔內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機封口。

2.3.3 培養(yǎng)

將上述封口好的97孔定量盤放入到生化培養(yǎng)箱中，在44.5±0.5 ℃培養(yǎng)24 h。

2.3.4 結(jié)果計數(shù)和計算

將培養(yǎng)24 h后的定量盤進行判讀，變黃則為糞大腸菌群陽性，若結(jié)果不能判斷，可延長培養(yǎng)時間至28 h。記下大孔和小孔變黃顏色的數(shù)量。查MPN表可得每100 mL樣品中糞大腸菌群的MPN值，再乘以稀釋倍數(shù)為原樣品中糞大腸菌群濃度(MPN/L)。

3 結(jié)果與討論

3.1 空白對照實驗

在進行各種驗證試驗時，應(yīng)同時進行空白實驗，要求檢測結(jié)果為定量盤大孔小孔均不得變色。

在進行培養(yǎng)基檢驗、陽性及陰性對照試驗，精密度分析和準確度分析時均使用無菌水進行空白對照實驗，實驗結(jié)果為97孔定量盤的大孔和小孔均未變色，空白對照合格。

3.2 陽性及陰性對照實驗

糞大腸菌群的陰性、陽性菌株參考表1。

表1 陰性、陽性菌株參考

此次購買的陽性菌種為大腸埃希氏菌，陰性菌株為產(chǎn)氣腸桿菌，對培養(yǎng)基分別進行陽性和陰性菌株檢驗實驗。將陽性菌株和陰性菌株進行傳代稀釋后，制成(0.3～3)×103個/mL的菌懸液，取100 mL配置好的菌懸液一次性倒入上述定量盤中，用程控定量封口機封口，然后在44.5 ℃±0.5 ℃下培養(yǎng)24 h。

陽性菌株和陰性菌株的測定結(jié)果表明，陽性菌株呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，檢測結(jié)果為6.0×102MPN/L。陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，培養(yǎng)基檢驗合格，陽性及陰性對照實驗驗證合格。

3.3 精密度分析

測量精密度表示測量結(jié)果中隨機誤差大小的程度，是指在規(guī)定條件下對被測量進行多次測量時，所得結(jié)果之間符合的程度[9]。隨機誤差越小，測量精密度越高。精密度一般用相對標準偏差(RSD)表示，一般要求至少重復(fù)測量6次，對高低濃度樣品和有證標準樣品，用97孔法進行6次重復(fù)測定，分別計算其平均值和相對標準偏差，測定結(jié)果見表2。根據(jù)標準HJ1001-2018要求，微生物檢測數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，標準偏差和相對標準偏差測定結(jié)果全部以10為底對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行計算。

表2 糞大腸菌群精密度測定結(jié)果

檢測結(jié)果表明，對高(污水處理廠進水，均值為4.7×107MPN/L)、低(污水處理廠出水，均值為5.1×102MPN/L)兩種濃度的樣品和有證標準樣品進行了6次重復(fù)測定的實驗室內(nèi)相對標準偏差范圍分別為1.0%、2.1%、2.6%。實際樣品和有證標準樣品在重復(fù)測定過程中，其平行樣的實驗室內(nèi)相對標準偏差滿足本方法精度控制要求，精密度測試驗證合格。

3.4 準確度分析

糞大腸菌群計數(shù)質(zhì)控樣品(FTQC-39-01)，糞大腸菌群標準樣品濃度參考值為11 MPN/mL(參考值范圍1～101 MPN/ml)，用97孔法進行6次重復(fù)測定，計算出絕對誤差，相對誤差。測定結(jié)果見表3。

表3 糞大腸菌群計數(shù)質(zhì)控樣品測定結(jié)果

糞大腸菌群計數(shù)質(zhì)控樣品6次重復(fù)測定的結(jié)果范圍為(2.4×103～4.2×103MPN/L)，滿足其參考值范圍(1～101MPN/mL)控制要求，6次重復(fù)測定的相對誤差范圍為：-10.4%～16.3%，滿足本方法準確度控制要求(標準要求的范圍為-17%～0.81%)，準確度測試驗證合格。

3.5 不確定度分析

3.5.1 不確定度的來源分析

不確定度的來源為取樣、操作者、時間、設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑和樣品的重復(fù)性[10～13]，在此次驗證實驗中，可量化的不確定度分量來源主要有取樣引入的不確定度、稀釋引入的不確定度及樣品重復(fù)性引入的不確定度。

具體分析如下。

低濃度樣品：樣品重復(fù)性引入的不確定度。

高濃度樣品：

(1)取樣過程中產(chǎn)生的不確定度，包括移液槍的體積校準引入的不確定度、溫度變化引入的不確定度。

(2)稀釋引入的不確定度，包括移液槍引入的不確定度(體積校準引入的不確定度，溫度變化引入的不確定度)，量筒的引入的不確定度(體積校準引入的不確定度，溫度變化引入的不確定度)。

(3)樣品重復(fù)性引入的不確定度。

3.5.2 不確定度分量分析

3.5.2.1 取樣過程中引入的不確定度

3.5.2.2 稀釋引入的不確定度

量筒引入的不確定度計算方法如表4。

表4 稀釋引入的不確定分量

因為要稀釋4次，稀釋引入的相對標準不確定度：

3.5.2.3 樣品重復(fù)性引入的不確定度

3.5.3 合成不確定度和擴展不確定度

3.6 方法驗證匯總

對照標準《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》(HJ 1001-2018)內(nèi)容要求，對本次驗證實驗進行了匯總。結(jié)果見表5。

表5 方法驗證匯總

3.7 質(zhì)量控制

(1)樣品采集時，應(yīng)用無菌采樣瓶、采樣袋或已滅菌的廣口的玻璃瓶，在采樣前需判斷所要采集的水樣是否含有活性氯。若有，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉，消除干擾。本次驗證實驗的低濃度樣品含有活性氯，所以使用的是帶有硫代硫酸鈉的無菌采樣瓶。

續(xù)表5

(2)采樣后應(yīng)在2 h內(nèi)進行檢測。若不能達到要求，在10 ℃以下冷藏不超過6 h。所以，當采樣點與實驗室距離較遠時，應(yīng)攜帶冷藏箱或車載冰箱[15]。

(3)在實驗過程中，每批次水樣需要進行空白對照試驗，并且按照標準要求購買有證標準菌株(如大腸埃希氏菌/產(chǎn)氣腸桿菌等)進行陽性和陰性對照試驗。

(4)高壓蒸汽滅菌器是用來對器皿和純水進行滅菌(保持在121 ℃，20 min)，若滅菌不徹底可能會造成樣品污染，結(jié)果不準確。所以必須嚴格控制滅菌溫度。

(5)糞大腸菌群的培養(yǎng)溫度有嚴格要求。所以，生化培養(yǎng)箱溫度必須穩(wěn)定，并且只在一定的范圍內(nèi)波動(44.5 ℃±0.5 ℃)，同時要對生化培養(yǎng)箱的溫度進行監(jiān)控[16]。

4 結(jié)論

從上述內(nèi)容可看出，本實驗室的儀器設(shè)備、試劑耗材標準物質(zhì)、環(huán)境要求滿足標準要求。對糞大腸菌群參數(shù)進行了驗證實驗，主要進行了空白對照實驗、陽性及陰性對照實驗、以及準確度和精密度驗證實驗，驗證實驗都符合標準要求。樣品不確定度分析表明稀釋引入的不確定度為貢獻最大的不確定度，其次取樣過程中引入的不確定度，最后是樣品重復(fù)性。因此，在實驗中要使用質(zhì)量較好的器皿，并且適當增加測量次數(shù)。綜上所述，該項目可在本實驗室開展。