微生物膜物細菌群落多樣性變化對水體富營養化狀態的影響

張 彪

(北京環域生態環保技術有限公司，北京 100012)

1 引言

城市生活污水經過污水處理廠處理后作為景觀用水廣泛應用于我國較為缺水的北方地區[1]。但是污水處理廠出水中氮、磷含量較高，作為景觀水體容易發生水體富營養化[2]。仿生水草作為一種治理水污染的有效手段已經被廣泛使用，其原理是仿生水草表面形成微生物膜，依靠微生物的代謝分解水體中的有機物，吸收氮、磷等營養元素及礦物質，可以有效起到凈化水體的作用[3]。細菌是水生生態系統中重要的組成部分，也是微生物膜降解污染物的主要參與者，不同的細菌群落對于污染物降解具有一定的差異性，因此通過研究水環境治理過程中仿生水草微生物膜細菌群落多樣性變化和水體富營養化狀態的變化，揭示仿生水草微生物膜細菌群落變化對水體富營養化狀態的影響，了解富營養化水體中微生物群落結構變化具有重要意義[4，5]。環境微生物群落結構組成復雜，目前只有1%的細菌在實驗室環境中分離培養[6]，對于了解富營養化水體群落結構組成以及微生物膜多樣性造成了極大的障礙，利用高通量技術對富營養化水體中仿生水草微生物膜進行16SrDNA測序，得到了大量的基因序列，克服了傳統培養技術的局限性，可以全面準確地反映細菌群落結構組成對水體富營養化狀態變化的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本實驗所用人工生態基是碳纖維仿生人工水草，長200 cm，直徑5 cm，這種仿生人工水草具有比表面積大、親水性強、吸附能力強、強度高、質輕、耐腐蝕，使用壽命長的特點，可以在短時間內形成微生物膜，并且安全性好，不易造成二次污染。

2.2 實驗用水

本實驗的實驗裝置位于某景觀河道內，該景觀水體以污水處理廠尾水作為水源，由于水源中氮、磷含量較高，體缺乏管理，同時具有外源污染進入，最終導致水體富營養化嚴重，藍藻爆發，甚至水體一度出現黑臭現象，嚴重影響周邊居民的生活，喪失景觀水體的作用。該景觀水體水質如表1所示。

表1 實驗水體水質

2.3 實驗過程

本實驗主要采取了以下措施：實驗河段切斷了外源污染的進入，同時為了提高水體溶解氧，采取了人工曝氣增氧的措施，將人工水草以16根/m2的密度均勻布置于實驗河段水體中，人工水草長度與河道水深一致。

水樣采集及處理：仿生人工水草安裝完成后，每周采樣一次，進行水質檢測，水質監測項目包括：透明度、葉綠素、氨氮、總磷、總氮、CODMn，其中透明度現場測定，其余項目進行實驗室檢測。

生物膜樣品采集及處理：實驗過程中每個月采集一次人工生態基生物膜樣品，取水下20 cm處人工生態基微生物膜，置于滅菌培養皿，用干冰低溫保存送至上海生物工程有限公司進行高通量測序。

2.4 實驗項目分析方法

實驗主要測試指標及方法見表2。

表2 實驗測試指標及測試方法

2.5 水體富營養化綜合評價方法

水體富營養化評價方法有許多種，本文采用綜合營養狀態指數法[7]。

綜合營養狀態指數法計算公式為：

TLI(∑)=∑Wj·TLI(j)

(1)

式(1)中：TLI(∑)為綜合營養狀態指數；Wj為第j中參數的營養狀態指數的相關權重；TLI(j)為第j中參數的營養狀態指數。 以Chla作為基準參數則第j種參數的歸一化的相關權重計算公式為：

(2)

式(2)中：rij為第j種參數與基準參數Chla的相關系數；m為評價參數的個數。

表3 中國湖泊(水庫)部分參數與葉綠素a的相

湖泊富營養化狀況評價指標包括Chla、TN、TP、SD和CODMn五項，各項營養狀態指數計算如公式(3)～(7)所示：

TLI(Chla)=10×(2.5+1.086×LnChla)

(3)

TLI(TP)=10×(9.436+1.624×LnTP)

(4)

TLI(TN)=10×(5.453+1.694×LnTN)

(5)

TLI(SD)=10×(5.118-1.94×LnSD)

(6)

TLI(CODMn)=10×(0.109+2.661×LnCODMn)

(7)

式(3)～(7)中：Chla單位為mg/m3；SD單位為m；其他指標單位均為mg/L。

富營養化分級標準采用0～100一系列連續數字對湖泊(水庫)營養狀態進行分級：

綜合營養狀態指數TLI(∑)<30為貧營養，30≤TLI(∑)≤50為中營養，TLI(∑)>50為富營養，5070重度富營養，在同一營養狀態下，指數值越高，其營養程度越重。

3 實驗結果與討論

3.1 Alpha多樣性分析

由表4可知，通過對仿生人工水草微生物膜樣品進行高通量測序，得到總優化序列在31862-23268條，在97%相似性水平下，所有序列被劃分為3121-7136個OTUs，OTUs變化范圍很大，表明仿生水草微生物膜細菌群落基因序列多樣性和豐度具有較大變化。ACE指數、Chao指數和香農指數越高表明細菌群落微生物多樣性越高，辛普森指數越低表明細菌群落微生物多樣性越高，表4中5～7月份的ACE指數、Chao指數和香農指數呈上升趨勢，辛普森指數呈降低趨勢，其中，因此綜合分析結果顯示隨著試驗時間的延長，仿生人工水草微生物膜細菌群落多樣性及豐度顯著增加。

表4 97%水平下多樣性指數和豐度

3.2 仿生水草微生物膜細菌群落組成分析

不同時間段微生物膜細菌群落通過高通量測序共檢測出的微生物共涉及26個門，54個綱，以及一些未被分類的微生物OTU。圖1是5～9月份微生物膜細菌群落在門水平下的微生物膜細菌群落結構圖。

圖1 5～9月份微生物膜細菌在門水平分類和比例

由圖1可知，5～9月份微生物膜細菌群落結構組成差異較大，隨著實驗時間的延長，在門水平上微生物膜細菌群落豐度逐漸增大。雖然在不同時間段微生物膜細菌群落多樣性差異較大，但是在不同時間段仿生水草微生物膜中的變形菌門-Proteobacteria(48.68%～62.21%)、擬桿菌門-Bacteroidetes(2.67%～16.04%)、厚壁菌門-Firmicutes(2.01%～13.8%)、浮霉菌門-Planctomycetes(0.71%～9.29)、疣微菌門-Verrucomicrobia(0.14%～26.12%)、藍藻菌門-Cyanobacteria(2.22%～16.24%)、綠彎菌門-Chloroflexi(0.17%～3.24%)，硝化螺旋菌門-Nitrospirae(0～1.56%)、酸桿菌門-Acidobacteria(0.02%～1.56%)等9個細菌門占優勢。其中，5～9月份仿生水草微生物膜細菌群落中變形菌門的相對豐度占有絕對優勢，所占比例分別為49.03%、62.21%、48.72%、53.43%和48.68%。王紹祥等[9]對水庫春季樣品進行16S測序在門水平上的結果表明：優勢物種分別是變形菌門、藍藻菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、放線菌門、綠灣菌門、厚壁菌門、疣微菌門和酸桿菌門，與筆者實驗過程中對微生物膜樣品進行高通量測序在門水平上所得結果相似，屬于典型的水生微生態系統類群。

3.3 微生物膜降解污染物機理—以硝化細菌去除氨氮為例

微生物膜細菌群落優勢物種如圖2所示，其優勢物種相對于傳統活性污泥更豐富，包括變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、疣微菌門、藍藻菌門等。有研究表明在不同污水、廢水活性污泥處理系統中細菌群落分布主要以變形菌、綠彎菌、放線菌、厚壁菌和擬桿菌為功能菌群[10]，降解水體中的污染物。有研究顯示變形菌門可以有效去除水體中的有機物[11]。厚壁菌門屬于革蘭氏陽性菌，可以在有氧或缺氧的環境中進行新陳代謝，并主要參與硝化和反硝化過程[12]。浮霉菌門微生物廣泛存在于厭氧環境中，如淡水水體、海洋沉積物、污水處理系統以及土壤中[13]。其中大部分浮霉菌門種類對水體中的氨氮及亞硝酸鹽氮均有較好的去除作用[14]。擬桿菌有利于促進含氮物質的利用、類固醇生物轉化及水解大分子物質等[15]。從這些研究成果中可以發現不同種類的微生物對于水體中的污染物的去除具有一定的選擇性和差異性。生物膜法和活性污泥法對污染物去除的主要作用原理及菌群基本一致，因此從微觀上分析，仿生水草微生物膜細菌群落多樣性的升高，對于去除水體中的污染物種類及效果具有正向作用，仿水草微生物膜多樣性增加也可以更有效地降解水體中的污染物，抑制水體富營養化。

圖2 門水平下微生物膜細菌群落豐度柱狀

硝化螺旋菌是生物脫氮的重要參與者，能夠通過硝化作用將氨氮轉化為硝酸鹽氮，從而去除水體中的氨氮，是典型的脫氮生物。由圖3可知，隨著實驗時間的延長，在門水平上硝化螺旋菌含量具有顯著提升，5月份的最低相對豐度為0，7月份最高相對豐度達到1.56%。之所以發生這種現象，推測可能是由于前期黑臭水體溶解氧處于缺氧或厭氧狀態，硝化細菌等好氧菌受到抑制，在人工水草微生物膜中含量很低未能檢測到。采取人工充氧措施后，黑臭水體溶解氧含量逐漸升高，厭氧、缺氧狀態得到改善，硝化細菌等好氧微生物活躍，相對豐度顯著提升，這對實驗水體脫氮具有正向作用。從圖3可以看出，隨著微生物膜硝化螺旋菌豐度的提高，水體中的氨氮含量呈顯著下降趨勢。通過SPSS對氨氮濃度和硝化螺旋菌豐度在95%置信區間進行相關性分析，微生物膜硝化螺旋菌豐度和氨氮濃度相關系數為-0.713，呈負相關。在門水平上隨著硝化螺旋菌相對豐度的提高，可以有效降解水體中的氨氮，消除水體黑臭，降低水體富營養化程度。

圖3 硝化螺旋菌豐度變化曲線和氨氮變化柱狀

實驗時間為5～9月份，實驗過程中得到的實驗數據是在水體溫度相對適合微生物生長代謝的情況下得到的，但是缺少微生物膜在低溫狀態下的相關數據，因此實驗得出的結論對于微生物膜在適宜溫度下適用，在低溫狀態下微生物膜豐度及水處理效果仍需驗證。

3.4 水體富營養化變化

綜合營養狀態指數-TLI(∑)[16]能夠綜合評價水體富營養化，對水體富營養化程度可以進行一個清晰直觀的判斷。從表5中可以看出：在5個月內，氨氮、高錳酸鹽指數、TP、TN等污染物含量顯著下降，綜合營養狀態指數逐漸下降，綜合富營養化指數從5月份的TLI(∑)=85.7(重度富營養)，到9月份的TLI(∑)=57.7(輕度富營養)，水體富營養化指數顯著下降，從重度富營養化狀態逐漸下降至輕度富營養化狀態。實驗結果表明：仿生水草微生物膜技術可以有效去除水體中的污染物，對改善水體富營養化具有顯著效果。

表5 水體富營養化變化

3.5 微生物膜細菌物種多樣性與水體富營養化相關性

微生物膜細菌群落結構組成、微生物數量受到外界環境因子的影響，表現出多樣性，而微生物細菌群落結構、多樣性以及微生物量也可以對外界環境產生影響，因此微生物細菌群落多樣性與外界環境因子之間存在一定的相關性。圖4是香農指數和富營養化變化圖，從圖4中可以看出：通過仿生水草微生物膜處理可以顯著改善水體富營養化，從5～9月份，實驗水體從重度富營養狀態，逐漸改善為輕度富營養狀態，水體水質得到顯著改善，同時隨著水體水質等外界環境因子變化，香農指數也發生了一定的變化，表明仿生水草微生物膜細菌多樣性受到外界環境的影響也發生了一定的變化，本實驗中仿生人工水草微生物膜在門水平上主要以變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、疣微菌門、藍藻菌門、綠彎菌門，硝化螺旋菌門、酸桿菌門為優勢種，通過上文可知在微生物膜上優勢種在門水平上多樣性隨著時間的延長具有顯著變化，因此可知仿生水草微生物膜細菌群落多樣性與水體富營養化程度存在一定的相關性。

圖4 香農指數和富營養化指數變化

微生物膜細菌群落多樣性與環境因子及富營養化指數相關性如表6所示。從表6中可以看出，香農指數與TN、TP、高錳酸鹽指數、葉綠素a濃度、透明度具等外界環境因子呈負相關關系，說明采用仿生水草生物膜法治理黑臭水體污染過程中，仿生水草微生物膜細菌群落多樣性與氮、磷和有機物等污染物呈負相關關系，仿生水草微生物膜細菌群落多樣性高有利于水體中污染物的去除，其中香農指數與TN、TP和高錳酸鹽指數相關性較高，相關性指數分別為-0.840、-0.789和-0.814，說明微生物膜細菌群落多樣性對氮、磷和有機物等環境因子影響相對更大；香農指數與富營養化指數呈負相關，相關性指數為-0.784，表明微生物膜細菌多群落樣性與水體富營養化狀態呈負相關關系，仿生水草微生物膜細菌群落多樣性能夠在一定程度上影響水體富營養化程度，仿生水草微生物膜細菌群落多樣性高能夠提高污水處理效率，可以在一定程度上抑制水體富營養化。

表6 細菌群落多樣性與不同環境因子相關性

4 結論

Alpha多樣性分析中ACE指數、Chao指數、香濃指數、辛普森指數均表明隨著實驗的進行，5～9月份仿生水草微生物膜細菌群落多樣性呈上升趨勢。仿生水草微生物膜，屬于典型的水生微生態系統類群，在不同時間段以變形菌門-Proteobacteria(48.68%～62.21%)、擬桿菌門-Bacteroidetes(2.67%～16.04%)、厚壁菌門-Firmicutes(2.01%～13.8%)、浮霉菌門-Planctomycetes(0.71%～9.29)、疣微菌門-Verrucomicrobia(0.14%～26.12%)、藍藻菌門-Cyanobacteria(2.22%～16.24%)、綠彎菌門-Chloroflexi(0.17%～3.24%)，硝化螺旋菌門-Nitrospirae(0～1.56%)、酸桿菌門-Acidobacteria(0.02%～1.56%)等9個細菌門為優勢種，其中變形菌門在不同時間段均為絕對優勢種。根據微生物對污染物去除機理的不同，微生物對于水體中的污染物具有一定的選擇性和差異性，仿生水草微生物膜細菌群落多樣性升高，對于去除水體中的污染物種類及效果具有正向作用，使仿水草微生物膜更有效降解水體中的污染物。通過對仿生水草微生物膜細菌群多樣性、富營養化指數以及不同環境因子進行相關性分析，結果表明：TN、TP和有機物對仿生水草微生物膜多樣性影響相對更大，呈負相關；微生物膜多群落樣性與水體富營養化狀態呈負相關關系，仿生水草微生物膜群落多樣性升高能夠在一定程度上抑制水體富營養化程度，實驗水體隨著仿生水草微生物膜細菌群落多樣性的升高，由富營養化水體逐步改善至輕度富營養化水體，水體富營養化程度得到顯著改善。