maspin、Cyclin-1與胃癌臨床分期及VEGF的相關性分析

王 力，邸 靜

商洛國際醫學中心醫院病理科，陜西商洛 726000

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，其發生、發展和轉移存在多因素、多階段過程，且具有發展快、預后較差等特點，是現階段嚴重危害人們生命健康的重要因素之一。胃癌患者根治術后5年存活率僅維持在20%～30%，因此，胃癌的早期診斷及治療對于改善預后有重要意義[1]。maspin 是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，相關研究表明，maspin可作為一種抑癌基因，對降低癌細胞活性、誘導癌細胞凋亡、減少腫瘤組織內血管新生等均具有調節作用[2]。細胞周期調控異常易引發腫瘤形成，而Cyclin-1是調控細胞周期的重要細胞因子，Cyclin-1基因發生移位或擴增會導致其在胃癌組織中過度表達，從而加重病情[3]。血管內皮生長因子(VEGF)是誘導腫瘤血管生長的關鍵因子之一，VEGF是已知最強有力的血管生成因子，在腫瘤的持續生長和轉移中起重要作用。相關研究表明，VEGF的表達與胃癌的分期、淋巴結轉移及預后密切相關，參與胃癌的發生和發展[4]。在對maspin、Cyclin-1、VEGF作用的研究中發現，3項指標均可作為判斷腫瘤侵襲和轉移的潛能因子，并且在胃癌遠處轉移和預后預測中均具有一定作用，也在胃癌治療中明確病理的發生和發展具有一定影響，但具體機制還需進一步研究[5-6]。本研究對maspin、Cyclin-1與胃癌臨床分期及VEGF的相關性進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年5月本院收治的進行根治手術的240例胃癌患者作為研究對象，男126例，女114例；≤50歲126例，>50歲114例；賁門部75例，胃體部86例，胃竇部79例；Borrmann分期：Ⅰ、Ⅱ期135例，Ⅲ、Ⅳ期105例；管狀腺癌63例，黏液腺癌57例，印戒細胞癌39例，鱗狀細胞癌81例；腫瘤最大徑≤4.0 cm 136例，>4.0 cm 104例；組織學類型：高分化型85例，中分化型87例，低分化型68例；有漿膜浸潤109例，無漿膜浸潤131例；有淋巴結轉移96例，無淋巴結轉移144例。不同病理類型、不同Borrmann分期、有無漿膜浸潤及有無淋巴結轉移等一般資料比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其余資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。納入標準：所有患者均經病理檢查確診為胃癌；術前未經放療、化療或其他腫瘤相關治療，所有患者臨床資料均完整。排除標準：有其他腫瘤病史，代謝異常性疾病，患急性心、腦血管疾病，肺、肝、膽、腎等重要器官發生可見占位性病變。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 鼠抗人maspin濃縮型單克隆抗體，兔抗人Cyclin-1、VEGF濃縮型多克隆抗體和免疫組織化學檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。

1.3 方法

1.3.1 標本留取 所有胃癌標本均行常規10%甲醛固定，均在24 h內取材。標本采集：于距病灶3 cm以外的癌旁組織取1塊，癌中心部位取1塊，使用切片機將組織切片，每張切片厚度為3～5 cm。染色前將石蠟切片置于二甲苯中脫去石蠟，采用10%甲醛固定做石蠟切片，依次采用無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇和 70%乙醇脫水后，用清水沖洗，在90 ℃烤箱中烘烤20 min后于蘇木素中染色10 min，清洗后，65 ℃烤箱烘干后用中性樹脂封片，組織切片于顯微鏡下觀察后拍照。

1.3.2 免疫組織化學染色法 將二甲苯脫蠟2次，每次10 min，梯度95%乙醇水化2次,每次3 min,80%乙醇水化3 min，70%乙醇水化3 min，蒸餾水水化2次，每次5 min,后置于盛有pH值為6.0的檸檬酸鹽緩沖液修復盒中，壓力鍋中高壓修復3 min。3% 過氧化氫37 ℃ 孵育10～20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min，滴加一抗maspin、Cyclin-1及VEGF工作濃度分別為1∶200、1∶400 和1∶700，37 ℃ 孵 育60 min。滴加聚合物輔助劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG多聚體，37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加新鮮配制的四鹽酸氨基苯胺顯色液，顯微鏡下觀察3～5 min，至出現陽性結果而又無明顯背景著色時終止反應，自來水沖洗，蘇木精復染5 min，2% 鹽酸乙醇分化10 s，自來水返藍15 min，切片自然風干，中性樹膠封片。maspin、Cyclin-1蛋白表達以細胞質、細胞核中出現褐色或棕黃顆粒為陽性染色，VEGF表達以細胞質中出現褐色或棕黃色顆粒為陽性染色，按每張切片隨機取5個高倍鏡視野，計數100個細胞，陽性細胞數≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分;陽性強度黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。0～6分表示陽性(+)，8～12分表示強陽性(++)，所得積分相乘，將(+)、(++)歸為表達陽性組計算陽性率。

1.3.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 所有患者均于治療前清晨抽取空腹靜脈血5 mL，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，吸取血清至 Eppendof 管中，做好標記，-80 ℃冷凍保存備用，采用 ELISA 按照試劑盒說明書進行嚴格操作，以450 nm 處測定吸光度值共3次，取平均值，參照廠家提供的血清VEGF水平及吸光度標準曲線讀取標本中血清VEGF水平。

2 結 果

2.1 胃癌組織與癌旁組織maspin、Cyclin-1陽性表達情況比較 胃癌組織中maspin陽性42例，Cyclin-1陽性174例；癌旁組織中maspin陽性198例，Cyclin-1陽性66例，與胃癌組織比較，癌旁組織中maspin陽性表達情況較高，Cyclin-1陽性表達情況較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

圖1 胃癌組織和癌旁組織maspin陽性表達情況比較(×200)

圖2 胃癌組織和癌旁組織Cyclin-1陽性表達情況比較(×200)

表1 胃癌組織及癌旁組織maspin、Cyclin-1陽性表達情況比較[ n(%)]

2.2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者maspin、Cyclin-1陽性表達情況比較 Ⅰ期胃癌患者maspin陽性21例，Cyclin-1陽性36例；Ⅱ期胃癌患者maspin陽性12例，Cyclin-1陽性48例；Ⅲ期胃癌患者maspin陽性9例，Cyclin-1陽性42例；Ⅳ期胃癌患者maspin陽性0例，Cyclin-1陽性48例。各期胃癌患者maspin和Cyclin-1陽性表達情況比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與Ⅰ期胃癌患者比較，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者Cyclin-1陽性表達情況差異均有統計學意義(P<0.05)；Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者Cyclin-1陽性表達情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖3 各期胃癌患者maspin陽性表達情況(×200)

圖4 各期胃癌患者Cyclin-1陽性表達情況(×200)

表2 各期胃癌患者maspin、Cyclin-1陽性表達情況比較[ n(%)]

2.3 各期胃癌患者VEGF表達水平比較 Ⅰ期胃癌患者VEGF表達水平為(62.60±7.22)pg/mL，Ⅱ期胃癌患者為(85.20±15.25)pg/mL，Ⅲ期胃癌患者為(118.30±22.34)pg/mL，Ⅳ期患者為(140.30±30.56)pg/mL，各期胃癌患者VEGF表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

2.4 胃癌患者maspin、Cyclin-1與VEGF的相關性分析 maspin與VEGF呈負相關(r=-0.365，P<0.05)，maspin與Cyclin-1呈負相關(r=-0.298，P<0.05)，Cyclin-1與VEGF呈正相關(r=0.386，P<0.05)。見圖6。

注：與Ⅰ期比較，*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05；與Ⅲ期比較，△P<0.05。

圖6 胃癌患者maspin、Cyclin-1與VEGF的相關性分析

3 討 論

胃癌是由多基因調節和多因素導致的細胞大量增殖及細胞凋亡受抑制的結果，Cyclin-1作為周期蛋白的調控基因，當基因表達異常時會引起細胞周期調節失控，促進腫瘤的發生和發展[7]。maspin在生物學功能中通過抑制腫瘤細胞活性進而提高細胞的黏附能力和細胞外基質的穩定性,降低癌變細胞運動能力，抑制腫瘤增長，誘導癌細胞凋亡[8]。腫瘤的生長和轉移依賴于腫瘤相關血管的形成，并為其提供營養物質，以及為腫瘤細胞進入循環系統提供通道。目前，常用的評價血管生成的指標主要為VEGF，作為腫瘤細胞分泌的最重要的腫瘤血管形成促成因子，其在腫瘤的發生和發展過程中起重要作用[9]。因此，加強對maspin、Cyclin-1、VEGF在胃癌中的作用機制研究，可為胃癌今后的診斷、治療及預后提供依據。

近年來相關研究發現，maspin、Cyclin-1在胃癌患者中的表達水平與腫瘤的生長和癌細胞轉移及浸潤等均具有相關性，maspin、Cyclin-1在正常胃黏膜組織和胃癌組織中均有不同表現，且在胃癌組織中的表達與癌旁組織中的表達水平存在明顯差異[10]。本研究結果顯示，胃癌組織中maspin陽性表達較低，Cyclin-1陽性表達較高，癌旁組織中maspin陽性表達較高，Cyclin-1陽性表達較低，二者呈負相關，提示maspin表達缺失、Cyclin-1表達升高在胃癌中可能發生致癌基因的作用。WANG 等[11]研究表明，胃癌組織中maspin的表達缺失高達71.00%，maspin的低表達和表達缺失與胃癌的分化、分期及腫瘤的生物學特性和臨床預后、治療轉歸等均密切相關，且maspin在胃癌組織中表達下調可能導致癌細胞黏附增加和細胞運動能力加強，引起胃癌發生和發展。相關研究顯示，Cyclin-1可與周期抑制蛋白相結合增強癌細胞活性，Cyclin-1過表達可加速細胞周期進展甚至使細胞向惡性轉化，Cyclin-1也是控制真核細胞周期進展的重要蛋白分子，可結合細胞周期蛋白依賴性激酶4而形成復合物Cyclin D1-CDK4，使Rb蛋白磷酸化，將細胞周期從低分期進入高分期，進而加重胃癌病變[12-13]。

maspin、Cyclin-1在胃癌分期中的表達水平與胃癌的惡性程度具有重要相關性，因此，maspin、Cyclin-1在參與胃癌發生和發展過程中可能是重要的生物學標志物。本研究中胃癌患者maspin陽性呈低表達，與之相反，Cyclin-1在胃癌患者中陽性呈高表達，由此提示，maspin、Cyclin-1水平與胃癌分期具有相關性。BOSTANCI等[14]通過免疫組織化學法研究表明，高分期胃癌中maspin的陽性表達明顯低于胃癌低分期，且發現maspin在低分期中主要表達于細胞質，而在高分期中主要表達于細胞核中。隨著胃癌分期增加，maspin在胃癌中胃黏膜的表達量隨之降低，表明maspin在胃癌中呈低表達且腫瘤的惡性程度較高，檢測其水平對預后評估具有重要意義[15]。HUANG等[16]研究顯示，Cyclin-l在胃癌低分期中能夠形成復合物，并通過激活蛋白激酶的活性使母細胞瘤蛋白磷酸化，進行轉錄因子釋放，進而驅使癌細胞由低分期進入高分期，促進癌細胞增殖和腫瘤發生。Cyclin-1過表達能夠提前實現母細胞瘤蛋白的磷酸化過程，同時加快細胞從低分期向高分期的轉變速度，增加癌細胞增殖。

有關研究證實，所有惡性腫瘤的生物學行為均與腫瘤內新生血管有關，而腫瘤血管的生成在實體腫瘤的發生、發展、浸潤及轉移等各階段均具有促進作用[17]。VEGF是已知最強有力的血管生成因子，并且可作為胃癌診斷、治療及預后動態觀察的指標。本研究中Ⅰ期胃癌患者VEGF表達水平最低，并且隨著分期越高VEGF表達水平不斷升高，表示VEGF與胃癌分期具有相關性，也是胃癌等惡性生物學行為的重要標志。相關研究表明，在處于進展階段的胃癌中，腫瘤組織增生活躍會分泌大量的VEGF進入血液，可能是由于環氧化酶的過度表達促進了前列腺素的合成，進而刺激VEGF分泌，伴隨腫瘤血管形成和胃癌分期升高，進而促進胃癌的侵襲和轉移能力，這也是晚期胃癌患者血清VEGF水平較高的重要原因[17]。唐歡等[18]研究表明，胃癌組織內的大量新生腫瘤血管的形成受多種血管生成因子的調節，在排除創傷和炎性反應前提下，血清VEGF水平呈高表達，提示腫瘤分期的提高可能伴隨活躍癌癥中新生血管因子及潛在癌細胞轉移的趨勢。因此，VEGF在胃癌的發生和發展中具有重要作用。ZANG等[19]研究結果顯示，maspin與VEGF、Cyclin-1的表達水平均呈負相關，原因可能是因為maspin陽性表達下調或缺失為腫瘤的浸潤轉移創造了適合的微環境，間接促進了Cyclin-1、VEGF-C等的表達、分泌及趨化作用。而maspin陽性表達下調后對凋亡相關基因的誘導作用下降，又為癌細胞浸潤后淋巴細胞的增殖創造了條件，進一步上調VEGF、Cyclin-1的表達水平。

綜上所述，maspin在胃癌組織中呈低表達，Cyclin-1在胃癌組織中呈高表達，且不同分期胃癌患者maspin、Cyclin-1陽性表達情況及VEGF水平不同，提示通過檢測maspin、Cyclin-1陽性表達情況及VEGF水平對胃癌的診斷和分期有重要作用。