線粒體去乙酰化蛋白SIRT3在噪聲誘導隱匿性聽力損失中的作用

楊紫荊 趙春麗梁文琦陳鐘壡 柳 柯 龔樹生*

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100050；2.首都醫科大學耳聾疾病臨床診療與研究中心，北京 100050)

噪聲性聽力損失(noise-induced hearing loss, NIHL)是最為常見的感音神經性聾之一[1]。現代社會日益成為一種充滿噪聲源的環境，因此NIHL也得到了廣泛關注。聽力損害的程度與接觸噪聲的種類、強度和時間等因素密切相關，研究[2-3]表明，短時中等強度的噪聲暴露僅造成暫時性聽力閾移 (temporary threshold shift, TTS), 這種聽閾變化可在噪聲后一段時間內恢復的現象被Liberman等[2]命名為隱性聽力損失 (hidden hearing loss, HHL)。研究[3-4]表明噪聲性隱性聽力損失(noise-induced hidden hearing loss, NIHHL)雖不會引起永久性聽力下降，但會造成耳蝸內結構的損傷，具體表現為內毛細胞 (inner hair cell, IHCs)與螺旋神經節神經元之間帶狀突觸(ribbon synapses, RS)的損害，從而影響聲音的處理，是NIHHL的重要致病機制。

線粒體是哺乳動物細胞有氧呼吸的主要場所，其代謝產物活性氧(reactive oxygen species, ROS)的累積近年來被認為是NIHL的主要發病機制之一[5-6]。因此，線粒體功能正常是內耳細胞進行多種生理活動的必要條件。線粒體主要的去乙酰化蛋白(sirtuin-3, SIRT3)是Sirtuins家族中的一員，在維持細胞氧化還原穩態和能量調節中起著重要的作用[7]。研究[8-10]表明，SIRT3可抵抗耳蝸內氧化應激從而保護聽力，然而其在NIHHL中是否也發揮同樣的作用還不明確。因此，本研究建立了NIHHL小鼠模型，通過抑制SIRT3來探討其在NIHHL中的具體作用，為噪聲性聾的發生和防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SIRT3抑制劑[3-(1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridine, 3-TYP] (美國MCE公司)；5%(體積分數)山羊血清(北京中杉金橋生物技術公司)；0.3%(體積分數)Triton X-100(美國Sigma公司)；4-羥基壬烯醛 (4-hydroxynonenal, 4-HNE)抗體(英國Abcam公司)；CtBP2抗體、Myosin-VIIa抗體 (美國BD Biosciences公司)；山羊抗鼠IgG1 Alexa Fluor 568抗體、山羊抗兔IgG (H+L) Alexa Fluor 647抗體(美國Invitrogen公司)。

1.2 實驗動物與分組

C57BL/6J雄性小鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0010，實驗動物的使用遵循醫學實驗動物管理實施細則以及首都醫科大學實驗動物管理細則。對小鼠聽力初篩排除異常小鼠后，將其采用數字表法隨機分為對照組 (Control組，n=8)、噪聲組 (NE 組,n=8) 和3-TYP組(n=8)。其中3-TYP組在噪聲前1周對小鼠進行腹腔注射3-TYP，50 mg·kg-1·d-1，連續7 d，而噪聲組只接受噪聲暴露，未做其余處理。兩組小鼠均在6周齡接受噪聲，并于噪聲后24 h及2周進行ABR測聽(圖1)。以上所有組別小鼠均于12 h暗環境中飼養，每籠最多5只，可自由進食和飲水。所有涉及實驗動物的實驗流程和操作都經過首都醫科大學倫理審查委員會批準，倫理審批號：AEEI-2018-011。

圖1 小鼠噪聲暴露模式圖 Fig.1 Schematic diagram of noise exposure in mice

1.3 噪聲暴露

將噪聲組及3-TYP組小鼠置于隔音室內相對的兩個揚聲器中間，暴露于100 dB聲壓級(sound pressure level, SPL)的寬帶白噪聲2 h。功率放大器與調音臺相連接，Cool Edit Pro軟件 (Adobe Systems, San Jose, CA)對聲音進行編輯合成。

1.4 聽力測試

為了評估噪聲后小鼠的聽力情況，對其進行了聽覺腦干反應 (auditory brainstem response, ABR) 測試。小鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮麻醉后，置于隔音室內，分別將參考電極插入待測耳乳突后，記錄電極插入顱頂正中皮下，地極插入對側耳乳突后。特定頻率click、4 kHz、8 kHz、16 kHz、32 kHz聲音刺激以5 dB為間隔從90 dB依次衰減至0 dB，通過耳道內的塑料管傳遞給小鼠，并記錄可重復波形處最小聲音強度為聽力閾值和90 dB處 ABR I波的幅值。以上所有測試及聽力評估均由同一人完成。

1.5 帶狀突觸計數

脊椎脫臼法處死小鼠，取雙側耳蝸浸泡于4% (質量分數) 多聚甲醛中4 ℃固定過夜。10% (體積分數) EDTA脫鈣后，于鏡下剝離外殼、外側壁、蓋膜等結構，將剩余基底膜分為頂中底三轉，置于含有5% (體積分數) 山羊血清和0.3% (體積分數) Triton X-100的破膜液中，室溫破膜2 h，4 ℃條件下，一抗(1∶500)孵育過夜，待PBS磷酸鹽緩沖液洗滌3次后，加入二抗(1∶300)室溫孵育2 h。樣本在共聚焦顯微鏡下(Hessen公司, 德國)掃描成像，從頂回至底回，分別選取3個區域，對每個區域內大約10個內毛細胞下的突觸進行計數。

1.6 冰凍切片染色

取材固定后的剩余耳蝸于10% (體積分數) EDTA脫鈣12 h，再置于30% (質量分數) 蔗糖溶液中脫水2 h，OCT (Tissue-Tek)包埋過夜。將制備完成的耳蝸標本以10 μm厚度進行平行于蝸軸的冰凍切片，并在孵育相應的一抗及二抗后，于共聚焦顯微鏡下掃描成像。最后用Image J 軟件對熒光強度進行分析。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 抑制SIRT3對小鼠聽力的影響

為了研究噪聲對不同組別小鼠的影響，通過ABR測聽檢測了不同頻率處小鼠的聽力閾值。與對照組相比，噪聲組小鼠在噪聲后一天4 kHz、8 kHz、16 kHz、32 kHz頻率處聽力閾值明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，且以高頻聽力損失嚴重，差異有統計學意義(P<0.001)。這種聽力變化在第14天基本恢復正常(P>0.05，圖2A、B)。3-TYP組小鼠在噪聲后一天各頻率處聽力閾值均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.001)，在第14天聽力閾值雖有恢復趨勢，卻未能達到正常水平 (P<0.05，圖2A、C)。同時，記錄噪聲后第14天4 kHz、8 kHz、16 kHz、32 kHz 4個頻率下90 dB SPL的I波幅值。噪聲后的小鼠I 波幅值顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且在3-TYP組更為明顯，差異有統計學意義(P<0.001，圖2D)。

圖2 噪聲后1 d和14 d NE組及3-TYP組ABR聽力閾值的變化Fig.2 Changes of ABR threshold in the NE group and 3-TYP group one day and fourteen days after NE

2.2 抑制SIRT3可加重耳蝸帶狀突觸損害

為了研究噪聲是否引起了內耳結構的損害，取耳蝸基底膜進行了免疫熒光染色。與對照組相比，各組別間內外毛細胞數量及形態未見明顯變化，然而在噪聲后第14天NE組小鼠中轉帶狀突觸的丟失，差異有統計學意義(P<0.01)，且3-TYP組小鼠帶狀突觸的丟失比NE組更為明顯，差異有統計學意義(P<0.001, 圖3)。

圖3 噪聲后第14天不同組別耳蝸中轉耳蝸帶狀突觸計數 Fig.3 Quantification of ribbon synapses in IHCs of the middle turn of cochlea in the different groups after fourteen days of NE

2.3 抑制SIRT3可使耳蝸組織氧化應激水平升高

為了檢測耳蝸內的ROS水平，采用冰凍切片進行4HNE染色。與對照組相比，在噪聲組與3-TYP組小鼠IHCs中4HNE表達均有升高，且3-TYP組升高更為明顯，差異有統計學意義(P<0.001, 圖4)。

圖4 抑制 SIRT3后內毛細胞ROS的累積情況Fig.4 ROS accumulation in IHCs after inhibition of SIRT3

3 討論

NIHL按病理狀態可分為兩種：暫時性聽力損失和永久性聽力損失。其中，僅在噪聲暴露后出現暫時性聽力閾移的聽覺功能障礙被稱為NIHHL[11-13]。噪聲后內耳的氧化應激可能與這種改變有關。SIRT3是定位于線粒體的一種去乙酰化蛋白，在過去的實驗中，被證實參與維持各系統氧化還原的穩態，也可在熱量限制下介導抗氧化系統的激活，預防年齡相關性聽力損失[8, 14-15]。在體外實驗[16]中證實了ROS 誘導的線粒體氧化損傷會驅使毛細胞凋亡，而SIRT3 對于保護線粒體功能和保護耳蝸免受氧化損傷至關重要。為進一步研究SIRT3在耳蝸中的作用以及NIHHL的發病機制，對小鼠進行了中低強度的NE，與之前的報道[17-18]一致，小鼠在噪聲后聽力閾值明顯升高，并在兩周后恢復正常，表現為TTS。3-TYP是一種SIRT3特異性抑制劑，在其他研究[19-20]中被證實通過腹腔注射，能有效降低SIRT3濃度。本研究結果顯示，在使用3-TYP抑制SIRT3后，經過噪聲暴露的小鼠2周后聽力雖有恢復趨勢，但未能達到正常水平，因而筆者推測SIRT3在NIHHL中可能抵抗噪聲所帶來的影響。

聲音的感受與處理很大程度上取決于耳蝸內感覺毛細胞的功能狀態。已有研究[21]證實，表現為TTS的動物，雖未有聽力受損，但IHCs與螺旋神經節細胞 (spiral ganglion cells, SGCs)之間的突觸連接中斷，形成了內耳早期損傷。既往研究[22]也表明，耳蝸內有害性ROS的累積可造成DNA等生物大分子的損傷，影響線粒體功能，從而影響聽力。為了闡明SIRT3保護內耳的具體機制，取小鼠耳蝸基底膜進行了形態學研究。結果顯示，噪聲后兩周的小鼠雖未見有毛細胞損傷，但其RS在中高頻聽力所在區域發生丟失，且抑制SIRT3后，這種丟失更為明顯。這與ABR測試中I波幅值的降低相應，表明了RS功能的異常。本研究還發現，與對照組相比，噪聲后小鼠IHCs內4HNE表達增加，且在3-TYP組更為明顯，這些結果表明噪聲可引起耳蝸內ROS累積，并造成帶狀突觸的損傷，而SIRT3的抑制使其對抗氧化應激的能力下降。

NIHHL是一種噪聲引起的僅表現為帶狀突觸損傷的聽覺功能障礙。盡管已有研究[16, 23]證明了SIRT3對耳蝸細胞的保護作用，但針對其在噪聲后內耳中作用的體內研究還比較少。本研究中，短時間中等強度的噪聲暴露雖未給聽力帶來直接影響，但已然在內耳中形成了早期氧化損傷，而SIRT3的下調使耳蝸細胞中ROS累積增加，從而加重了帶狀突觸的丟失，影響噪聲后聽力的恢復，闡明了其對聽覺系統的保護作用，可能是通過抵抗氧化應激以保護帶狀突觸來實現的。然而SIRT3的抗氧化作用是多種通路共同參與的結果，今后將在此基礎上，將目光聚焦于其上下游分子，進一步完善NIHL的研究，從而為臨床相關疾病的防治提供可能的藥物靶點和理論依據。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明楊紫荊：實驗、數據收集和論文撰寫; 趙春麗：數據收集; 梁文琦、陳鐘壡：數據分析; 柳柯、龔樹生：研究設計和論文指導。