醬香型白酒釀造微生態中酵母菌的研究進展

戎梓溢，白茹，閆學嬌，李超，林良才，張翠英

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

醬香型是中國白酒四大典型香型之一，是以高粱、小麥、水等為原料，經傳統固態法發酵、蒸餾、貯存、勾兌而成的蒸餾酒，具有代表性的貴州茅臺酒、湖南武陵酒、四川郎酒等均屬此類。醬香型白酒的風格特征在所有蒸餾酒中最具特色，其酒體色澤微黃或透明，香氣幽雅細膩，口感醇厚豐滿，醬香突出，回味悠長，深受世界消費者青睞。醬香型白酒的特殊風味離不開釀造微生物的貢獻，制曲、堆積等過程是在相對開放的環境下進行，來源于原料、空氣、地面、工具及其他環境中的微生物在大曲及酒醅中得到大量的富集。酵母菌是釀造過程中主要的微生物菌群，不僅具有良好的產酒性能，還可以在酶的作用下產生多種揮發性風味物質，對醬香型白酒風格的形成具有重要作用[1]。為闡明酵母菌群與醬香白酒品質之間的聯系，本文重點介紹醬香型白酒釀造過程中酵母菌的多樣性、菌群結構及其主要功能。從酵母菌代謝產物的角度揭示了醬香型白酒發酵的內在機理以及呈香機制，為功能酵母在白酒生產中的實際應用提供了理論依據，同時對醬香型白酒的科學生產具有指導意義。

1 醬香型白酒釀造微生態中酵母菌概述

1.1 酵母菌種類

酵母菌是釀造環境中最主要的微生物，在醬香型白酒的制曲、堆積及窖池發酵整個釀造過程中均可被檢測出，且種類繁多。目前，科研人員應用傳統可培養方法并結合現代分子生物學鑒定手段，已鑒定出醬香白酒釀造環境中核心酵母種類。這些酵母菌按照其功能可分為兩類：一是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），它們是釀造醬香型白酒的發酵動力，可以通過自身代謝，將底物葡萄糖轉化為乙醇及二氧化碳。因此，釀酒酵母被認為是酒體中乙醇的主要來源；二是非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae），這些酵母菌的產乙醇能力相對較弱，但其代謝產物對白酒的香氣、風格及品質具有重要影響，例如扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）可以分泌β-葡萄糖苷酶、蛋白酶及纖維素酶等多種水解酶類作用于大曲、酒醅中的相關底物，促進原料分解，提高酒精產量[2]；畢赤酵母屬（Pichia）、漢遜酵母屬（Hansenula）、假絲酵母屬（Candida）等在白酒固態發酵過程中，能夠利用葡萄糖代謝產生酯、酸、醛及高級醇等風味物質[3]；粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）具有一定的脫酸能力，可以將醬香型白酒生產中的乙酸平均濃度從9.62 g/kg降低到6.55 g/kg，并且還具備降解某些異味物質的能力[4]。由此可見，非釀酒酵母與釀酒酵母在白酒釀造過程中發揮著同等重要的作用，兩者相互協調，成就了醬香型白酒獨特的風格特點。

1.2 醬香型白酒釀造過程中酵母菌的動態變化

酵母菌是釀造環境中最主要的微生物，在醬香型白酒的制曲、堆積及窖池發酵整個釀造過程中均可被檢測到，但不同階段總體占比、群落結構以及各自的豐度是不斷變化的，醬香型白酒釀造過程中酵母菌多樣性見表1。

表1 醬香型白酒釀造過程中酵母菌多樣性Table 1 Diversity of yeast in the fermentation of Maotai-flavor liquor

1.2.1 醬香型白酒大曲中酵母菌的菌群結構

高溫制曲是醬香型白酒獨特的制曲方式，大曲中的微生物以芽孢桿菌為代表的細菌為主，霉菌次之[14-15]。酵母菌在入室低溫培菌階段快速繁殖，占大曲微生物總量的2%～5%，但隨著曲堆的溫度逐漸升高，其頂點溫度可達62℃，酵母細胞耐高溫能力較弱，生長受到抑制。早期研究認為在制曲中后期只能檢測出少量，甚至檢測不出酵母。近年來，隨著免培養技術的發展，李豆南等[16]發現在高溫制曲過程中盡管多數酵母被淘汰，但依然有部分酵母菌處于存活或休眠狀態。羅方雯等[17]通過高通量測序技術，在醬香型白酒1～7輪次的大曲中鑒定出了39種酵母屬，其中Saccharomycopsis、Wickerhamomyces及Millerozyma分布頻率為100%且平均相對豐度分別為89.15%、6.14%和2.84%，被認為是高溫大曲中的優勢酵母屬。此外，扣囊復膜酵母、畢赤酵母、東方伊薩酵母、假絲酵母等諸多產酯生香酵母在高溫大曲中也被陸續分離鑒定出來[18-19]。這充分地表明雖然在大曲中分離得到的酵母數量不多，但其種類豐富。

1.2.2 醬香型白酒堆積發酵中酵母菌的菌群結構

在醬香型白酒釀造工藝中，堆積發酵是必不可少的關鍵環節，該過程能使醬香大曲中的酵母快速繁殖，并且可以富集環境中獨特的產酯酵母及其他功能微生物[20-21]，在微生物代謝和各種酶的作用下生成醬香的前驅物質，保證窯池發酵的順利進行，被稱為“二次制曲”。酵母菌群在堆積初期繁殖較快，其數量在第2天達到頂峰，隨后由于出甑酒醅不斷上堆，堆子的體積加大，空氣不足，酵母菌數量有所下降，但仍是酒醅中的優勢微生物，占總菌數的72.55%[22]。唐玉明等[23]追蹤了堆積酒醅中酵母菌的動態變化，結果顯示在堆積結束后，酵母菌的數量由最初103個/g糟上升至108個/g糟，且發酵酒醅堆中不同空間位置的酵母菌總量呈現明顯差異，堆上和堆中酵母數量增長最快。此外，Wu等[24]研究發現堆積酒醅中不同位置的主導酵母種類有所不同，拜氏接合酵母及釀酒酵母是堆積發酵過程中最主要的酵母，分布在堆子頂部和底部位置，而粟酒裂殖酵母及膜醭畢赤酵母主要存在于堆積發酵后期，分別在堆子中心位置及堆子表面被大量檢出。這說明了堆子中各點的溫度、酸度及氧濃度等環境因子，影響了酵母菌群的結構。隨著對堆積酒醅中酵母菌種屬認識的逐漸加深，除常見的釀酒酵母外，絲孢酵母、假絲酵母、白地霉等產酯酵母均能在堆積酒醅中被檢測出來，豐富多樣的酵母菌群對醬香風味有著積極貢獻。因此，掌握堆積過程中酵母菌的種群變化，對于控制白酒發酵有著很重要的意義。

1.2.3 醬香型白酒窖池發酵中酵母菌的菌群結構

窯池發酵是產酒產香最主要的時期，酵母菌被視為發酵動力的來源，能夠產生大量酒精以及高級酯類物質，對酒體風格及出酒率有著重要的影響。在入窖酒醅中，酵母菌的數量隨著發酵時間的推移而逐漸減少，唐玉明等[25]通過對郎酒第4輪次窯內酒醅酵母數量進行追蹤發現，入窖時酒糟中酵母含量為108個/g糟，而出窖時下降到了104個/g糟，相差4個數量級，這種下降趨勢說明了隨著營養物質的消耗及微生物有害代謝產物的累計，窖池發酵時已經不再是酵母繁殖及富集階段。進一步研究發現，同一輪次不同位置的酵母菌數量有明顯差異，上層酒醅中的酵母數量要高于中層和下層[11]。分析認為，這是由于窖頂封泥可能存在縫隙，使上層酒醅中的酵母實現了與外界的氣體交換，氧氣濃度更高，更適合酵母菌生長。此外，吳徐建等[12]研究表明，窖內酒醅中酵母的種屬差異不明顯，拜爾接合酵母、粟酒裂殖酵母和釀酒酵母是窖池發酵酒醅中最主要的3種酵母。邵明凱等[24]從酒質較好的第5輪次及酒質較差的第7輪次酒醅中分離得到了東方伊薩酵母、德爾布有孢圓酵母、盔狀畢赤酵母、阿氏絲孢酵母、費比恩畢赤酵母等，并且發現第5輪次發酵前期酵母菌的數量、種類均比第7輪次豐富，通常認為這是在第7輪次酒醅中營養物質匱乏，并且有機酸等不利酵母生長的代謝產物積累所致，這也證明了醬香型白酒發酵過程中酵母群落多樣性及豐富度是造成好和差輪次白酒產量和品質差異的重要原因。

2 醬香型白酒中酵母菌的功能特性

2.1 對脅迫環境的適應性

釀造環境對酵母菌的生長及代謝有著十分重要的作用。醬香型白酒生產工藝的特點可以概括為“四高兩長”，即高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒、生產周期長、存儲時間長。整個發酵體系中的溫度相對較高，酒醅中的有機酸、酒精含量高，這些環境中的脅迫因子加速了酵母細胞老化，甚至發生凋亡，嚴重地限制了酵母菌的生長，導致酒精發酵效率低，發酵基質中殘淀粉含量高，不僅使最終酒體品質下降，也大大地增加了企業成本。因此，篩選具有良好的發酵性能并且對釀造微生態中不良環境因子有較強耐受性的工業生產酵母菌株已成為亟需解決的問題。

溫度對于酵母菌的生長及代謝有較大影響，其最適生長溫度為28℃～30℃，當環境中溫度過高時會導致酵母細胞膜被破壞、酶失活、代謝能力降低[26-27]。醬香白酒制曲階段，曲磚品溫最高可達65℃，堆積酒醅表面溫度在48℃左右，窖內發酵過程溫度也達到38℃～39℃，這樣的溫度條件對酵母菌的高溫耐受性提出了極高的要求。寇運同等[28]對高溫大曲內的耐高溫酵母進行了分離，得到了一株能在47℃生長良好的耐高溫酵母，可利用12種碳源，具有一定的產酒、產酯能力，經鑒定為卡斯特假絲酵母（Candida casterllani）。黃永光等[10]在高溫堆積酒醅中分離得到的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、白地霉（Galactomyces geotrichum）對溫度均有較強耐受能力。徐超英等[29]在堆積酒醅中篩選出了一株耐高溫的庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），生長耐受最高溫度達45℃，同時展現出良好的耐酒精及耐糖性能。眾所周知，高溫條件下仍保持較快的發酵速度及較高糖利用率的酵母是白酒發酵后期正常進行的保障，因此，篩選耐高溫功能酵母、研究其耐熱機制并應用于實踐生產，對提高白酒發酵效率有著十分重要的作用，這也是當今研究的熱點。

此外，由于醬香白酒發酵周期長，酒醅中各類產酸微生物代謝所形成的難揮發性酸類物質不斷積累，導致發酵酒醅長期處于低pH值環境，使酵母細胞發生酸化，并且隨著發酵的進行，環境中的酒精濃度逐漸上升，這些脅迫因素均對酵母生理代謝產生不利影響。在長期脅迫條件下，醬香酒醅中的酵母已進化出一定的適應性。周陽子等[30]從高溫大曲篩選出一株高產淀粉酶的扣囊復膜酵母JM，其在液體培養條件下，產酶量為1 452 U/mL；能耐受20%（體積分數）的酒精濃度、30%的糖度和17%的NaCl，在pH 3.0、49℃條件下均能較好生長。王莉等[31]利用多次傳代篩選的方式，獲得了一株高乳酸耐受性的庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），最高可在120 g/L的乳酸條件下生長，并且可以產生多種酯類，特別是乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯產量較高；同時研究顯示庫德里阿茲威氏畢赤酵母具有良好的降解乳酸能力，與釀酒酵母在40 g/L乳酸條件下共培養時，可以顯著提升釀酒酵母耐酸水平[32]。莊孝杰等[33]從醬香型酒醅中篩選得到一株性狀優良的拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii），可耐受 pH2.0、37℃高溫及8%乙醇，發酵后乙醇含量達33.58 g/L，法呢醇、辛酸乙酯、癸酸、月桂酸、4-叔丁基苯酚等風味物質總產量達415.27 μg/L。路曉偉等[34]、Lu 等[35]在醬香酒釀造環境中篩選到了一株高耐受力、高發酵效率的釀酒酵母MT1，在42℃下，16%乙醇及pH2.0條件下表現出良好的生長性能。同時，其具有廣泛的碳源利用圖譜，可產生多種揮發性物質，其中苯乙醇、乙偶姻和大馬酮產量分別達到模式菌株S288c的8、9倍和3倍。

由此可見，醬香酒醅中的酵母菌經過長期的自然篩選及馴化，對不利環境條件已經出現了一定的適應性，在保障自身生長的基礎上，還能代謝出豐富的香氣物質。因此，有目的地選育高脅迫條件下代謝依然旺盛的酵母菌株，并將其應用于生產實踐，有利于提高原料轉化率、產酒率及白酒品質，也為改善傳統工藝提供了新途徑。

2.2 酵母菌代謝產物對白酒的風味貢獻

醬香型白酒的主體為水和乙醇，占比約為98%～99%，其余的1%～2%為各類風味物質，據不完全統計醬香型白酒中的微量化合物約800種～1000種[36-37]。在白酒釀造過程中，酵母菌不僅可以通過糖酵解途徑產生大量的乙醇，并且可以分泌一些酶類，使原料中的相關底物發生氧化、還原、脫水、水解等復雜反應，從而形成白酒中各類的風味物質，賦予酒體濃郁的芳香，對酒體完美和豐滿具有重要作用[38]。隨著氣相色譜-質譜、多維氣相色譜-質譜等現代科學儀器的應用，使酵母菌風味代謝產物的相關研究成果更為豐富。不同種類的酵母菌所產生的風味代謝物有所不同，但總體可歸納為醇類、酯類、酸類、醛類及某些特征香氣成分，具體如圖1所示。

圖1 醬香型白酒中功能酵母的部分代謝產物Fig.1 Some metabolites of functional yeast in the fermentation of Maotai-flavor liquor

醇類物質表現出柔和的刺激感和微甜、濃厚的感覺，具有“助香”的作用。醬香白酒中醇類物質占比較大，釀酒酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬等具有良好的生產乙醇性能，在無氧條件下，可以通過糖酵解途徑將原料中的葡萄糖轉換為乙醇，是白酒發酵的動力；正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇等高級醇類主要依賴酵母菌埃利希（Ehrlich）或Harris代謝途徑合成。另有研究報道婁德酵母（Lodderomyces elongisporus）、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、絲孢酵母（Trichosporon coremiiforme）代謝葡萄糖可以產生甘油、D-阿拉伯糖醇、赤醉糖醇、山梨醇、麥芽糖醇等多元醇類[39]。

酯類物質通常具有一定的水果香氣，酒體中主要可以表現出微甜、帶澀，并還可以體現出一定的苦味和刺激感，是提高香氣濃厚程度的主要因素[40]。醬香白酒在下沙和糙沙階段可檢出的酯類很少，大部分的酯類在一輪次起窖時才被檢出，并且隨著輪次酒增加先上升后下降，其中乳酸乙酯及乙酸乙酯是醬香酒中含量最高的酯類物質[41-42]，而丁酸乙酯含量相對較少。酵母菌可以在酯化酶的作用下，將乙酸、己酸、丁酸、乳酸等有機酸與乙醇進行酯化，最終生成相應的酯類。存在于醬香酒醅中的產酯酵母如漢遜酵母、假絲酵母等，具有較強的酯合成能力，賦予白酒濃郁的芬芳。王曉丹等[43]在醬香型白酒酒醅中分離到了一株假絲酵母屬的平常假絲酵母（Candida inconspicua），其具有較高的乙酸乙酯產量。趙群麗[44]在醬香大曲分離出一株發酵能力較好，具有良好產酯作用的酵母MT-2，其發酵產物的酒精度為（8.17±0.29）%vol，總酯含量達（2.48±0.14）g/L，經鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

酸類物質在白酒中起到協調酒體的作用，是影響白酒口感的主要因素之一。醬香型白酒中的酸類物質種類繁多，含量遠超其他香型白酒[45]，其中乙酸、丙酸、己酸及乳酸是最主要的4種有機酸。在釀造過程中產酸微生物以乙酸菌、乳酸菌等細菌為主[46-47]，但近年來也有研究表明[48]，釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、東方伊薩酵母、畢赤酵母、哈薩克斯坦酵母、拜爾接合酵母及漢遜德巴得酵母對揮發性酸類的形成有著較大的貢獻，其中，東方伊薩酵母產酸的種類和數量最為突出，2-甲基丙酸和壬酸產量較高。粟酒裂殖酵母和哈薩克斯坦酵母產酸量僅次于東方伊薩酵母，粟酒裂殖酵母所產的酸類代謝物主要為乙酸和壬酸，并且是唯一能產生辛酸的酵母；哈薩克斯坦酵母可以產生乙酸、己酸、壬酸、丁酸和癸酸等揮發性酸。

此外，酵母菌還可以產生某些關鍵醬香風味物質，如4-乙基愈創木酚、吡嗪類及呋喃類物質[34，49-51]。目前醬香白酒的主體風味物質在學術界仍沒有定論，但可以肯定的是醬香經典風味一定是多種物質相互協調的結果。因此，對酵母菌生香機制的研究，不僅有助于闡釋醬香風味形成的機理，也開辟了利用產香酵母菌來改善和強化白酒風味的新方向。

2.3 酵母菌與其他功能微生物間的互作分析

“多微共酵”是醬香白酒釀造過程中的顯著特點，酒醅中各種微生物之間彼此聯系、相互影響、共同代謝，形成了獨具特色的醬香風味白酒。因此，僅從單培養的角度分析酵母菌的功能及作用是片面、不充分的。相對地，通過研究酵母菌與其他菌種混合發酵，能更好地認識酵母菌在整個釀造體系中所承擔的“角色”。

醬香型白酒中主要的酵母菌與其他功能菌間的關系如圖2所示。

圖2 醬香型白酒微生物相互作用關系示意圖Fig.2 Schematic diagram of microbial interaction in the fermentation of Maotai-flavor liquor

當釀酒酵母與地衣芽孢桿菌混菌發酵時，釀酒酵母對地衣芽孢桿菌的生長具有抑制作用，而地衣芽孢桿菌對釀酒酵母的生長無影響，且能夠提升釀酒酵母代謝產風味物質的能力。在混合發酵體系中，釀酒酵母產醇、產酸能力顯著提升，特別是丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸和酒石酸的產量高于純培養1.23、2.11、1.76、2.02、1.04 倍和1.63 倍[52]。其他研究還發現醬香酒醅中的乳酸菌XJ-L1（Lactobacillus homohiochii）與 XJ-L2（Lactobacillus buchneri）對釀酒酵母 XJ-Y1（Saccharomyces cerevisiae）、拜爾接合酵母 XJ-Y2（Zygosaccharomyces bailii）及盔狀畢赤酵母 XJ-Y3（Pichia galeiformis）的生長具有促進作用，并且對這3種酵母菌酸類、醇類、酯類等風味物質的產生發揮積極影響[53]。米曲霉（Aspergillus oryzae）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在最適混合比例條件下，可以提升乙醇的生成量，并且乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸等風味化合物的濃度顯著提升[54]。這些研究對于醬香型白酒發酵機理的認識具有重要作用，并且為其現代化與機械化發展提供了一定的理論與實踐基礎。目前，國內對于釀造微生物之間相互作用的機理研究尚處于起步階段，尤其是酵母菌與霉菌的互作關系尚不明確，這也成為日后業內研究重點之一。

3 醬香型白酒中功能酵母的應用

醬香酒醅中蘊含著豐富的酵母資源，合理地將功能性酵母應用到生產實踐當中，對于改善白酒的口感、豐滿酒體風格、提高白酒品質有著積極的作用。因此，越來越多的企業及科研人員開始從事相關的研究工作。盧君等[55]為解決糟醅中酸度過高引起的掉排現象，將高耐酸酵母作為強化菌株應用于發酵異常的糟醅中，顯著地提高了基酒的產量，其增幅約在13.47%～25.97%之間，且風味指標與對照無明顯差異，解決了糟醅中酵母因酸度過高，發酵力下降的問題。韓興林等[56]將發酵酵母BF01與產酯酵母BZ03混合后進行了入窖生產試驗，在不影響窖池出酒率的情況下，提升了白酒中甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯等9種酯類物質的含量，并且產物中高級醇類物質含量有所下降，正丙醇、異戊醇含量分別下降了3.9%及30.7%。劉濤等[57]從醬香型白酒堆積酒醅中分離得到了兩株優勢酵母Y2（釀酒酵母）與Y3（畢赤酵母），將其作為發酵菌種添加至糟醅后，生產出的麩曲醬香白酒的酯香味突出，醇甜味顯著，感官品評結果較好。由此可見，在醬香型白酒的釀造過程中，功能性酵母是一筆寶貴的生物資源，能為企業大規模生產帶來可觀的經濟價值。但目前還需對功能酵母的發酵機制，及其與醬香風味物質形成之間的關系進行深入研究，最大限度地挖掘功能酵母的潛力能更好地促進中國酒行業的發展。

4 展望

醬香型白酒在我國有著悠久的歷史，以其獨特的醬香風味而被人熟知。酵母菌廣泛存在于醬香型白酒制曲及釀造整個階段，其種類、菌群結構及動態變化與醬香風味的形成息息相關。目前的研究大多集中在優良酵母的分離、篩選及鑒定工作，而對酵母菌群生香機制及其風味代謝途徑的探索較少；同時，對高溫制曲工藝中功能酵母的多樣性及其作用的研究尚不深入，對大曲質量與功能酵母之間的關聯性的研究更是少之又少，未來著重研究二者的關系，對科學制曲、機械制曲具有重大意義；此外，醬香白酒的釀造過程十分復雜，釀造微生物種類繁多，相互作用，單單研究某一種功能微生物是遠遠不能夠闡釋白酒釀造機理及呈香機制，釀造微生物之間、釀造微生物與釀造環境之間的相互作用分析也是日后研究的重點方向。

隨著現代分子生物學技術的發展，結合宏基因組、宏轉錄組、宏代謝組等多組學技術，追蹤分析釀造過程中各個階段微生物菌群結構、功能及風味貢獻，對于改進生產工藝、提升醬香品質、促進原料轉化、推動白酒生產機械化及智能化方面均有指導意義。