抑制miR-101對糖尿病腎病模型大鼠腎組織中FOXO1蛋白和自噬水平的影響

周科挺 金依依 趙華軍

[摘要] 目的 探究抑制微小RNA（miR）-101對糖尿病腎病（DN）模型大鼠的影響以及對腎組織叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（FoxO1）和自噬的影響。方法? 通過腹腔注射鏈脲佐菌素建立DN模型，隨機選擇30只DN大鼠分為DN組（n=15）和DN+miR-101 antagomir組（n=15），15只健康大鼠作為對照組。尾靜脈注射miR-101 antagomir（300 μg）以抑制miR-101的水平。通過HE染色驗證建模結(jié)果和抑制miR-101對腎組織的保護作用。檢測和比較各組的腎功能指標(biāo)、miR-101、FoxO1 mRNA和蛋白、自噬蛋白（Beclin1和LC3Ⅱ）表達量。結(jié)果? 建模后和干預(yù)后，DN組和DN+miR-101 antagomir組的血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且均顯著高于對照組（均P<0.05）。三組大鼠的上述各項指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。DN組的24 h尿蛋白、肌酐和miR-101水平顯著高于對照組，F(xiàn)oxO1的mRNA和蛋白、Beclin1和LC3Ⅱ表達量顯著低于對照組（均P<0.05）。DN+miR-101 antagomir組的24 h尿蛋白、肌酐和miR-101水平顯著低于DN組，F(xiàn)oxO1的mRNA和蛋白、Beclin1和LC3Ⅱ表達量顯著高于DN組（均P<0.05）。結(jié)論? 抑制miR-101可以緩解DN大鼠腎組織損傷保護腎功能，并提高FoxO1蛋白表達量，促進細胞自噬。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病;糖尿病腎病;微小RNA-101;叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1;自噬

[中圖分類號] R587.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）16-0030-03

Effect of inhibiting miR-101 on level of FOXO1 protein and autophagy in kidney tissue of rats with diabetic nephropathy

ZHOU Keting1? ?JIN Yiyi2? ?ZHAO Huajun1

1.School of Pharmacy， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou? 310053， China; 2.Department of Pharmacy， Ningbo First Hospital， Ningbo? 315010， China

[Abstract] Objective To explore the effect of inhibiting microRNA （miR）-101 on diabetic nephropathy （DN） model rats， forkhead box O1 （FoxO1） and autophagy in kidney tissue. Methods A DN model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin. A total of 30 DN rats were randomly divided into the DN group and the DN+miR-101 antagomir group （n=15）， and 15 healthy rats were selected as the control group. MiR-101 antagomir （300 μg） was injected into the tail vein to suppress the level of miR-101. HE staining method was used to verify the modeling results and the protective effect of inhibiting miR-101 on kidney tissue. The renal function indicators， and expression levels of miR-101， FoxO1 mRNA and protein， and autophagy protein （Beclin1 and LC3Ⅱ） were detected and compared between the three groups. Results After modeling and intervention， there was no significant difference in blood glucose level between the DN group and the DN+miR-101 antagomir group （P>0.05）， and both were significantly higher than that in the control group （all P<0.05）. There were significant differences in the indicators mentioned above among the three groups （all P<0.05）. The 24-hour urine protein， creatinine and miR-101 level in the DN group were significantly higher than those in the control group. The expression levels of FoxO1 mRNA and protein， and Beclin1 and LC3Ⅱ in the DN group were significantly lower than those in the control group （all P<0.05）. The 24-hour urine protein， creatinine and miR-101 levels in the DN+miR-101 antagomir group were significantly lower than those in the DN group. The expression levels of FoxO1 mRNA and protein， and Beclin1 and LC3Ⅱ were significantly higher than those in the DN group （all P<0.05）. Conclusion Inhibiting miR-101 can alleviate damage of kidney tissue in DN rats， protect renal function， and increase expression of FoxO1 protein to promote autophagy.

[Key words] Diabetes; Diabetic nephropathy; MicroRNA-101; Forkhead box O1; Autophagy

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是由高濃度葡萄糖微環(huán)境引起的腎組織的纖維化和細胞凋亡，臨床表現(xiàn)為腎功能逐漸下降[1]。近年來，研究顯示免疫和自噬在DN進程中也起到關(guān)鍵作用[2]，細胞的自噬過程可將由高糖引起損傷的細胞器降解為小分子并重新利用，從而保護腎功能[3]。據(jù)報道，在DN進展中，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead box O1，F(xiàn)oxO1）與高糖誘導(dǎo)的腎小管細胞損傷有關(guān)[4];Fox O1還可從細胞水平緩解炎性反應(yīng)[5]。此外，該研究還顯示FoxO1的水平受到微小RNA（microRNA，miRNA）的靶向調(diào)控。最新研究發(fā)現(xiàn)miR-101參與糖尿病誘發(fā)的器官損傷，但miR-101在糖尿病腎病中的作用仍不清楚[6]。本研究主要討論抑制miR-101對DN模型大鼠FoxO1蛋白表達量和自噬水平的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

SD大鼠（SPF級，雄性，12周，210～250 g）。鏈脲佐菌素（Sigma公司，美國）。miR-101抑制劑（antagomir）（廣州瑞博生物技術(shù)有限公司）。HE染色試劑盒（C0105S）和ELISA試劑盒（碧云天公司，中國）。生化分析儀器（SMT100V，南京電子醫(yī)療器械廠）。RNAspin Mini和miRNeasy Mini試劑盒（GE Healthcare，美國）。Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）。TaqMan miRNA試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）。ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）。抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1000稀釋，#ab6721）（Abcam公司，美國）。硝酸纖維素膜（EMD Millipore，美國）。顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）。

1.2 大鼠分組、建模和干預(yù)方法

40 只大鼠構(gòu)建DN模型[7]，將鏈脲佐菌素溶解于pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液中，大鼠接受一次性腹腔注射，劑量為60 mg/kg，對照組大鼠注射等量緩沖液。用生化試劑盒在注射后第72 h測量血糖，高于16.7 mmol/L提示建模成功。本研究建模成功率為90%（36/40）。4周后隨機選擇3只大鼠通過HE染色檢測腎組織損傷情況和腎功能指標(biāo)。采用隨機數(shù)字表法將建模成功的30只大鼠分為DN組（n=15）和DN+ miR-101 antagomir組（n=15）。取注射等量緩沖液的大鼠15只作為對照組。DN+ miR-101 antagomir組大鼠每周尾靜脈注射miR-101 antagomir以抑制miR-101的水平[8]，每次300 μg，連續(xù)4周。本次動物實驗經(jīng)寧波市第一醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究福利倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.3.1 血清腎功能指標(biāo)? 采集尾靜脈血，通過生化分析儀檢測24 h尿蛋白和肌酐評估腎功能。

1.3.2 HE染色? 大鼠通過吸入過量的CO2進行安樂死，然后取出腎組織，于室溫下采用4%多聚甲醛固定6 h。對其進行HE染色。

1.3.3 RT-qPCR? 使用RNeasy Mini試劑盒提取腎組織中的總RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。

1.3.4 Western blot? 在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h以封閉非特異性抗原。使用Quantum One軟件分析灰度計算FoxO1蛋白、自噬相標(biāo)志蛋白（Beclin1和LC3Ⅱ）相對于GAPDH的表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，單因素方差分析（ANOVA）以評估組間差異，兩兩比較使用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖水平比較

建模后和干預(yù)后，DN組和DN+miR-101 anagomir組的血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但均顯著高于對照組（均P<0.05），且>16.67 mmol/L。見表1。

2.2 抑制miR-101對DN模型大鼠腎功能指標(biāo)的影響

三組的腎功能指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中DN組24 h尿蛋白和肌酐均顯著高于對照組（均P<0.05）;DN+miR-101 antagomir組24 h尿蛋白和肌酐均顯著低于DN組（均P<0.05）。見表2。

2.3 抑制miR-101對DN模型大鼠腎組織損傷的影響

對照組的腎小球和腎小管一切正常;DN組細胞出現(xiàn)水腫，腎小球膨大;DN+miR-101 antagomir組腎小球結(jié)構(gòu)基本完整，水腫有所緩解。見封三圖1。

2.4 抑制miR-101對DN模型大鼠腎組織中miR-101、FoxO1表達水平的影響

三組大鼠腎組織中miR-101、FoxO1 mRNA和蛋白表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。DN組的miR-101表達量顯著高于對照組，F(xiàn)oxO1 mRNA和蛋白表達量顯著低于對照組（P<0.05）。DN+miR-101 antagomir組的miR-101表達量顯著低于DN組，F(xiàn)OXO1 mRNA和蛋白表達量顯著高于DN組（P<0.05）。見圖1、表3。

2.5 抑制miR-101對DN模型大鼠腎組織中自噬水平的影響

三組大鼠腎組織中自噬水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。DN組的自噬標(biāo)志蛋白Beclin1和LC3Ⅱ表達量顯著低于對照組（均P<0.05）。DN+miR-101 antagomir組的Beclin1和LC3Ⅱ表達量顯著高于DN組（均P<0.05）。見圖2、表4。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，全世界超過4億人口患有糖尿病，每年造成370萬人死亡[9]。DN是引發(fā)終末腎臟疾病的最常見原因[10]。在DN中，促炎性細胞因子升高，影響腎單位的轉(zhuǎn)運蛋白和離子通道的功能[11]。

miRNA能夠靶向抑制多種基因的mRNA并抑制蛋白質(zhì)的最終翻譯[12，13]。miR-320a可通過抑制MafB的表達引起足細胞損傷加重DN中的腎臟功能障礙[14]。在1型糖尿病中，循環(huán)miR-101的表達增加并參與糖尿病誘發(fā)的臟器損傷[15]。本次研究顯示在DN大鼠模型中，腎組織中miR-101水平顯著升高，而抑制miR-101能顯著緩解腎組織損傷，保護腎功能，但其機制仍需要進一步研究。

研究顯示在DN中，F(xiàn)oxO1水平降低，提高FoxO1水平能夠緩解高糖引起的腎組織損傷、纖維化和細胞凋亡[16，17]。FoxO1受到miR-101的靶向調(diào)控，在乙肝病毒中，miR-101可通過抑制FoxO1蛋白水平調(diào)控其復(fù)制[18]。這提示miR-101可能通過抑制FoxO1參與DN。近年來研究顯示，自噬是細胞在高糖等壓力環(huán)境下自我保護的方式，其可通過將細胞中受損細胞器、活性氧自由基等送至溶酶體溶解[19]。研究顯示誘導(dǎo)自噬可減輕DN大鼠腎組織損傷[20]。本研究結(jié)果顯示抑制miR-101能夠顯著提高DN大鼠腎組織中FoxO1蛋白的表達，并促進自噬標(biāo)志蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的水平。Beclin1是自噬底物，其水平降低提示自噬開始，而LC3Ⅱ是自噬小體形成所必需的。據(jù)此可推測糖尿病引起的miR-101升高可能會導(dǎo)致FoxO1蛋白表達量的降低，并引起自噬通量的抑制。抑制miR-101可使FoxO1蛋白表達量升高，恢復(fù)自噬從而緩解DN引起的腎損傷，保護腎功能。

綜上所述，抑制miR-101可緩解DN大鼠的腎組織損傷，保護腎功能，并提高FoxO1蛋白表達量，促進細胞自噬。但關(guān)于miR-101在DN中的意義仍需要臨床研究證實，其調(diào)控FoxO1和自噬的分子機制也需要進一步分析。

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（收稿日期：2021-03-11）