鎘脅迫對(duì)延胡索生理及生物堿積累的影響

展曉日，吳琦聰，黃潔芳，沈晨佳，王慧中

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310036)

延胡索(Corydalisyanhusuo)別稱(chēng)元胡、玄胡索、玄胡，為罌粟科紫堇屬多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)江南丘陵地帶。延胡索是傳統(tǒng)道地藥材“浙八味”之一，以地下塊莖入藥，具有活血、化瘀、止痛等作用[1]。浙江東北部平原丘陵地帶包括嘉興、紹興和金華地區(qū)是延胡索的主產(chǎn)區(qū)，延胡索也是當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)的收入的重要來(lái)源[2-3]。現(xiàn)代藥學(xué)研究表明，延胡索制劑對(duì)于治療冠心病、胃腸潰瘍及多種腫瘤疾病具有良好藥效。而延胡索中的主要活性成分為多種特有的生物堿，如原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素等[4]。因此，生物堿含量是延胡索質(zhì)量的重要指標(biāo)。

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大量工業(yè)廢水進(jìn)入農(nóng)田水域，造成土壤重金屬?lài)?yán)重超標(biāo)。重金屬鎘(Cd)被作物吸收富集，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，可引起慢性中毒[5]。由此可見(jiàn)，重金屬Cd超標(biāo)對(duì)生態(tài)環(huán)境及人體健康造成很大影響[6]。針對(duì)延胡索重金屬脅迫的研究已有部分報(bào)道。余順慧等[7]研究表明，鉻污染對(duì)延胡索生長(zhǎng)和生理特性有顯著影響。李云躍等[8]發(fā)現(xiàn)，重金屬鉛對(duì)延胡索生長(zhǎng)及不同器官生物量的積累有顯著的抑制作用。但重金屬Cd脅迫對(duì)延胡索的生長(zhǎng)及生物堿產(chǎn)量的影響還尚且未知。本研究以延胡索為研究對(duì)象，設(shè)置不同濃度Cd處理，測(cè)定延胡索在Cd脅迫下的生理指標(biāo)和生物堿積累情況。本研究的結(jié)果對(duì)理解延胡索對(duì)重金屬Cd脅迫的響應(yīng)機(jī)制，優(yōu)化延胡索的栽培條件提供了實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和理論指導(dǎo)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)植物材料延胡索(Corydalisyanhusuo)栽培于杭州師范大學(xué)倉(cāng)前校區(qū)種植基地。

1.2 處理設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為延胡索塊莖，篩選大小一致的塊莖100塊左右，種植于獨(dú)立花盆(直徑30 cm)中，每盆裝土壤10 kg，進(jìn)行常規(guī)土肥管理。

本試驗(yàn)采用1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)處理組，每組3個(gè)平行重復(fù)。開(kāi)展Cd單一環(huán)境因子脅迫試驗(yàn)，處理組以CdCl2作為Cd2+來(lái)源。將栽培的延胡索幼苗取出后進(jìn)行水培，營(yíng)養(yǎng)液中的Cd2+濃度分別為0，100，200，300 μmol·L-1。鎘脅迫處理6 d后，收集延胡索幼苗葉片至1.5 mL離心管，用液氮冷凍后，移至-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 延胡索葉綠素、可溶性蛋白等含量測(cè)定

葉綠素含量采用紫外分光光度法測(cè)定。每組試驗(yàn)操作都進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。鮮葉片剪成細(xì)絲狀后準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g，放入加有25 mL丙酮-乙醇混合提取液(體積比為1∶1)的試管中，封口后將試管置于暗處直至葉片顏色完全變白。使用DU-800紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)分別在663、646和470 nm下測(cè)定浸提液的吸光值。

可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮法[9]。將樣品從-80 ℃冰箱中取出，稱(chēng)取250 mg，加入10 mL去離子水，煮沸30 min，定容于25 mL。顯色反應(yīng)吸取0.5 mL樣本溶液，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸，充分振蕩后置于沸水浴中煮沸，冷卻后，在630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

脯氨酸含量使用酸性茚三酮法測(cè)定。稱(chēng)取不同試驗(yàn)組的延胡索葉片各500 mg，加入3%磺基水楊酸5 mL，沸水浴10 min后，加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮試劑，沸水浴30 min，冷卻后加入4 mL甲苯終止反應(yīng)，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.4 延胡索丙二醛(MDA)含量測(cè)定

MDA采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[10]。稱(chēng)取延胡索葉片樣本1 g，加入10 mL的10% TCA緩沖液，研磨成勻漿，離心后得上清液。吸取2 mL上清液，以去離子水為空白對(duì)照，加入2 mL 0.6%的TBA緩沖液，沸水浴15 min，冷卻后離心取上清液，測(cè)定532 nm、600 nm和450 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

1.5 延胡索3種酶活性測(cè)定

使用武漢賽培生物科技有限公司試劑盒測(cè)定過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶(CAT、SOD和POD)活性，試驗(yàn)方法參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.6 延胡索不同生物堿含量測(cè)定

分別精確稱(chēng)量原阿片堿(5.24 mg)、小蘗堿(5.16 mg)、延胡索乙素(4.60 mg)和脫氫紫堇堿(5.06 mg)標(biāo)準(zhǔn)品，定容于10 mL容量瓶中，得到對(duì)照品母液，依次逐級(jí)稀釋。將延胡索塊莖取樣，粉碎之后精確稱(chēng)取0.5 g，加入氨水-甲醇(1∶20)混合液50 mL，冷浸1 h，熱回流1 h，冷卻后吸取濾液25 mL，蒸干后，用甲醇溶解所得固體物，定容后備用。

色譜柱為Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，三乙胺pH調(diào)為6.0；梯度洗脫程序?yàn)?∶100(0 min)→20∶80(15 min)→80∶20(35 min)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 22.0分析軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05表示樣本間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索總?cè)~綠素含量的影響

葉綠素是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需色素，是光合作用得以順利進(jìn)行的基礎(chǔ)條件，直接關(guān)系到光合作用的水平。使用0、100、200、300 μmol·L-1的鎘溶液，處理延胡索幼苗6 d，測(cè)定總?cè)~綠素含量的變化。結(jié)果表明，對(duì)照組的延胡索總?cè)~綠素含量為1.54 mg·g-1，6 d之后葉綠素含量基本保持不變；處理組葉綠素含量有著顯著下降，在100 μmol·L-1鎘脅迫下葉綠素含量下降為1.30 mg·g-1，在200 μmol·L-1鎘脅迫下葉綠素含量下降為1.11 mg·g-1，在300 μmol·L-1鎘脅迫下葉綠素含量下降為1.23 mg·g-1(圖1)。

*表示處理與對(duì)照間差異顯著(P<0.05)，圖2～4同。

2.2 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索脯氨酸含量的影響

近年來(lái)的研究表明，重金屬脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)脯氨酸的大量積累，以提高植株對(duì)重金屬脅迫的抗性和適應(yīng)性。使用0、100、200、300 μmol·L-1的鎘溶液，處理延胡索幼苗6 d，測(cè)定脯氨酸含量的變化。結(jié)果表明，對(duì)照組的延胡索脯氨酸含量為235.5 μg·g-1，6 d之后脯氨酸含量基本保持不變；處理組脯氨酸含量有著顯著上升，在100 μmol·L-1鎘脅迫下脯氨酸含量上升為446.1 μg·g-1，在200 μmol·L-1鎘脅迫下脯氨酸含量上升為475.1 μg·g-1，在300 μmol·L-1鎘脅迫下脯氨酸含量上升為390.5 μg·g-1(圖1)。

2.3 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索可溶性蛋白含量的影響

重金屬進(jìn)入植物體后會(huì)抑制各類(lèi)代謝活動(dòng)，尤其是蛋白質(zhì)的合成，而可溶性蛋白質(zhì)含量是重金屬脅迫的重要測(cè)定指標(biāo)。圖1表明，對(duì)照組的延胡索可溶性蛋白含量為1.47 mg·g-1，6 d之后可溶性蛋白含量基本保持不變；處理組可溶性蛋白含量有著顯著上升，在100 μmol·L-1鎘脅迫下可溶性蛋白含量上升為3.48 mg·g-1，在200 μmol·L-1鎘脅迫下可溶性蛋白含量上升為3.11 mg·g-1，在300 mmol·L-1鎘脅迫下可溶性蛋白含量上升為2.14 mg·g-1。

2.4 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索MDA含量的影響

MDA是重金屬脅迫下，植物生物膜系統(tǒng)受損的重要指標(biāo)，它反映膜脂過(guò)氧化的程度。如圖2所示，在對(duì)照組中MDA保持較低水平，鎘處理顯著誘導(dǎo)MDA含量水平(0.093 μmol·g-1)。在鎘處理6 d后，MDA含量顯著上升，其中在300 μmol·L-1鎘脅迫下上升接近十倍(0.951 μmol·g-1)。而鎘處理濃度越高，MDA含量積累也更高，表明在高濃度鎘脅迫下，植物膜脂系統(tǒng)遭到更為嚴(yán)重的破壞。

圖2 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索MDA含量的影響

2.5 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索的抗氧化酶活性的影響

CAT、SOD和POD是植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，它們?nèi)呦嗷f(xié)調(diào)配合可以有效地清除植物體內(nèi)的氧自由基和過(guò)氧化物。CAT具有極強(qiáng)的催化能力，將H2O2分解為O2和H2O。鎘脅迫導(dǎo)致CAT活性下降，從對(duì)照組的211.2 U·g-1，下降大約50%。其中，高濃度鎘處理(300 μmol·L-1)導(dǎo)致CAT活性下降最多，從211.2 U·g-1下降到109.2 U·g-1(圖3)。SOD是一類(lèi)超氧化物歧化酶，負(fù)責(zé)清除植物體內(nèi)的氧自由基。鎘脅迫導(dǎo)致SOD活性顯著下降，隨著鎘處理濃度的升高，SOD活性下降更為明顯。在300 μmol·L-1鎘處理下，SOD活性從155.0 U·g-1下降為86.4 U·g-1。POD和SOD發(fā)揮著同等作用，也是超氧化物歧化酶的一種。鎘脅迫導(dǎo)致POD活性顯著上升，在對(duì)照組下POD的活性?xún)H為535.7 U·g-1，在100 μmol·L-1鎘處理下POD活性上升最為顯著，達(dá)到2 954.8 U·g-1。隨著鎘處理濃度上升，POD活性上升幅度反而有所下降，在300 μmol·L-1鎘處理下POD活性為1 140.9 U·g-1。

圖3 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索3種抗氧化酶活性的影響

2.6 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索生物堿含量的影響

延胡索含有一系列生物堿，是其主要的活性成分，重金屬污染是否影響延胡索生物堿的含量是被關(guān)注的重要問(wèn)題。本研究中，選擇4種延胡索標(biāo)志性的生物堿類(lèi)活性成分，探索鎘脅迫處理對(duì)延胡索生物堿含量的影響。在鎘脅迫處理下，4種生物堿活性物質(zhì)含量均有所下降，其中小蘗堿的下降幅度最為明顯。原阿片堿含量在鎘脅迫處理下顯著下降，但是不同濃度的鎘處理對(duì)其含量影響不大(圖4)。小蘗堿含量在不同濃度鎘脅迫處理下并不相同，鎘濃度越高，其含量下降越顯著。延胡索乙素和脫氫紫堇堿在低濃度鎘脅迫下(100和200 μmol·L-1)下降幅度較小，在高濃度鎘脅迫處理下，下降幅度達(dá)到50%。

圖4 重金屬鎘脅迫對(duì)延胡索4種生物堿含量的影響

3 小結(jié)與討論

延胡索是我國(guó)重要的中藥材之一，也是其主產(chǎn)地藥農(nóng)增收的主要經(jīng)濟(jì)作物[11]。延胡索活性成分主要由各類(lèi)生物堿組成，生物堿的含量是延胡索經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要指標(biāo)。然而，延胡索活性成分含量會(huì)受到外界環(huán)境的影響，進(jìn)而影響到延胡索的藥效。有研究表明，影響延胡索活性成分含量的因素主要與延胡索品種、提取加工工藝、產(chǎn)地和環(huán)境因素等有關(guān)[12-13]。隨著環(huán)境污染的加劇，環(huán)境因素越來(lái)越成為影響延胡索品質(zhì)的決定性因素。

重金屬鎘是影響植物類(lèi)中藥材的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因子之一，危害人體健康。生理數(shù)據(jù)表明，鎘脅迫顯著降低延胡索中的葉綠素含量，說(shuō)明其可能通過(guò)降低延胡索光合生理特性而影響幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，這與其他多種植物在鎘脅迫下的表現(xiàn)一致，如水稻、夏枯草等[14-15]。此外，低濃度鎘脅迫顯著提高脯氨酸和可溶性蛋白的含量，說(shuō)明延胡索是鎘敏感性植物。

植物抗氧化酶系統(tǒng)影響植株主要和次生代謝產(chǎn)物的積累[16]。在鎘脅迫處理下，3種主要的抗氧化酶指標(biāo)均表現(xiàn)出顯著變化，說(shuō)明延胡索的次生代謝系統(tǒng)受到鎘脅迫的嚴(yán)重破壞。隨著鎘脅迫濃度的增加，CAT和SOD的活性變化較小，說(shuō)明CAT和SOD活性對(duì)鎘濃度不敏感。而低濃度鎘處理組的POD活性上升最為顯著，達(dá)到2 954.8 U·g-1(對(duì)照組POD活性為535.7 U·g-1)，但隨著鎘濃度的上升，POD活性逐漸下降，說(shuō)明高濃度鎘破壞了POD酶分解毒素的系統(tǒng)。鎘脅迫處理極大地削弱了抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)氧自由基的清除能力，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，進(jìn)而產(chǎn)出過(guò)量的MDA，損害膜功能，對(duì)細(xì)胞有極大的毒害作用。

測(cè)定了原阿片堿、小蘗堿、延胡索乙素和脫氫紫堇堿4種延胡索重要的生物堿在鎘脅迫下的變化情況，評(píng)價(jià)重金屬鎘污染對(duì)延胡索品質(zhì)的影響。原阿片堿在鎘脅迫下含量下降，但不同濃度的鎘處理對(duì)原阿片堿的含量影響不大，說(shuō)明原阿片堿的生物合成對(duì)鎘污染的程度不敏感。其中，小蘗堿含量受到鎘脅迫的影響最大，從對(duì)照組的54.3 μg·g-1降至300 μmol·L-1鎘處理下的18.4 μg·g-1，降幅接近70%。結(jié)果表明，鎘脅迫會(huì)影響延胡索主要活性物質(zhì)的含量，進(jìn)而影響延胡索藥材的品質(zhì)。

本研究表明，重金屬鎘處理破壞了延胡索的抗氧化酶系統(tǒng)，影響延胡索次生代謝的進(jìn)行。原阿片堿、小蘗堿、延胡索乙素和脫氫紫堇堿4種不同生物堿在鎘脅迫下含量均顯著下降，說(shuō)明鎘脅迫降低了延胡索的質(zhì)量，對(duì)延胡索的品質(zhì)造成嚴(yán)重?fù)p害，延胡索大規(guī)模栽培應(yīng)選擇在無(wú)鎘污染的土壤中進(jìn)行。