線粒體DNA T16189C變異與妊娠糖尿病的關系

張小勤，周玉蘭，付竹梅，韓學學，展 潔

（1.濰坊市婦幼保健院檢驗科，山東 濰坊 261011；2.濰坊市婦幼保健院超聲科，山東 濰坊 261011；3.濰坊市婦幼保健院產科，山東 濰坊 261011）

妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）可大大增加孕婦和胎兒發生并發癥及合并癥的風險[1-2]。部分在懷孕之前無胰島素抵抗表現的孕婦隨著孕期糖穩態的不斷受壓，會發展成GDM[3]。GDM與2型糖尿病有共同的病理生理基礎，且GDM患者未來發展為2型糖尿病的風險更高[4-5]。在對胰島素抵抗、肥胖和2型糖尿病的研究過程中，mtDNA T16189C變異引起了學者們的關注。該變異位點接近線粒體復制起始點，在維持細胞拷貝數和線粒體轉錄中起重要作用[6]。此外，線粒體單鏈DNA結合蛋白與mtDNA 16189C的結合力低于其與mtDNA 16189T的結合力。有研究結果顯示，在亞洲人群中，mtDNA T16189C變異的發生率與2型糖尿病患者空腹胰島素水平升高、胰島素抵抗和β細胞功能受損有關[7]。但這種變異是否能影響GDM的發病尚不清楚。為此，本研究擬探討mtDNA T16189C變異與GDM發生風險的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年1—10月濰坊市婦幼保健院定期產檢的GDM孕婦204例（GDM組），年齡（32.09±3.51）歲；正常孕婦220例（對照組），年齡（31.54±4.57）歲。所有孕婦均為單胎妊娠，孕期為24～28周。GDM診斷標準：（1）空腹血糖≥5.1 mmol/L；（2）口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）1 h血糖≥10.0 mmol/L；（3）OGTT 2 h血糖≥8.5 mmol/L。排除標準：（1）多胎妊娠；（2）孕前有糖尿病史和其他內分泌疾病史；（3）肝、腎功能不全；（4）有高血壓史；（5）近期服用過影響糖代謝的藥物；（6）有其他家族遺傳史。本研究經濰坊市婦幼保健院醫學倫理學委員會批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 對所有對象進行體格檢查，并詢問病史，收集臨床資料，包括年齡、孕周、體質量指數（body mass index，BMI）及空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、空腹胰島素（fasting insulin，FINS）檢測結果。計算胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）：HOMAIR=FINS×FBG/22.5。

1.2.2 mtDNA 16189變異位點檢測 采用乙二胺四乙酸抗凝管采集所有對象禁食8～12 h后的空腹靜脈血2 mL，充分混勻后采用血液基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取全基因組DNA，-20 ℃保存。采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）對mtDNA D-loop區進行擴增，試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，檢測儀器為PTC-200 PCR儀（美國伯樂公司）。擴增引物序列見表1。反應體系：總體積為30 μL，10×Ex Taq buffer 3 μL、dNTP 2 μL、PrimerF 1 μL，PrimerR 1 μL，Ex Taq 0.2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 20.8 μL。反應條件：96 ℃預熱5 min；96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環30次；72 ℃延長5 min，4 ℃保存。按96孔純化板（德國Millipore公司）說明書進行PCR產物純化。為了避免線粒體D-Loop區單測序結果受影響，保證測序的準確性，本研究使用2對測序引物進行雙重測序，測序引物序列見表1。由深圳華大基因測序公司完成測序。使用Chromas軟件（北京天演融智軟件有限公司）對基因序列進行分析，并與人mtDNA文庫記錄的劍橋參考序列（Cambridge reference sequence，CRS）進行比對，分析查找mtDNA 16189變異位點序列。

表1 擴增引物和測序引物序列

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗?；蝾l率分布比較采用χ2檢驗。基因變異對GDM的影響采用比值比（odds ratio，OR）和95%可信區間（confidence interval，CI）表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GDM組與對照組一般資料比較

GDM組FBG、OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、HbA1c和FINS均高于對照組（P<0.05），年齡、孕周和BMI 2個組之間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 GDM組與對照組一般資料比較

2.2 mtDNA T16189C變異與GDM的關系

GDM組有72例（35.29%）攜帶mtDNA T16189C變異位點，對照組有57例（25.91%）攜帶該變異位點。GDM組mtDNA T16189C變異頻率高于對照組（χ2=4.40，P<0.05）。測序結果見圖1。

圖1 mtDNA16189位點測序結果

攜帶mtDNA T16189C變異位點是GDM發生的危險因素（OR=1.36，95%CI為1.020～1.823）。

2.3 mtDNA T16189C變異與妊娠期胰島素抵抗的關系

根據是否攜帶mtDNA T16189C變異將GDM孕婦分為攜帶組和非攜帶組。攜帶組OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、FINS、HOMA-IR水平高于非攜帶組（P<0.05），FBG、HbA1c2個組之間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 mtDNA T16189C變異攜帶組與非攜帶組各項指標比較

3 討論

雖然多數GDM孕婦產后糖代謝可恢復正常，但其未來患2型糖尿病的風險是正常孕婦的7倍[4]。目前，多數學者認為胰島素抵抗是GDM的病理生理基礎，貫穿著GDM發生、發展的全過程[7]。由于線粒體在能量產生和自由基生成中起關鍵作用，所以線粒體基因組可能對多種能量代謝相關疾病的產生和發展有重要影響[8]。1998年，POULTON等[9]提出mtDNA T16189C變異與胰島素抵抗有關。隨后的研究結果顯示，mtDNA T16189C位點變異與胰島素抵抗、BMI、代謝綜合征和心血管疾病有關[10]。因此，為進一步了解mtDNA T16189C變異是否與GDM有關，本研究對GDM孕婦的mtDNA T16189C變異情況進行了分析，結果顯示，GDM組mtDNA T16189C變異頻率高于對照組（P<0.05），攜帶mtDNA T16189C變異是GDM發生的危險因素（OR=1.36，95%CI為1.020～1.823）。

妊娠期出現胰島素抵抗是屬于妊娠期的生理代謝變化。本研究結果顯示，GDM組FINS顯著高于對照組（P<0.05），提示GDM孕婦與正常孕婦相比存在更嚴重的胰島素抵抗。另外，mtDNA T16189C變異攜帶組FINS、HOMAIR水平均高于非攜帶組（P<0.05），說明攜帶mtDNA T16189C變異的GDM孕婦的胰島素抵抗情況更嚴重。但關于mtDNAT16189C變異在GDM發生中的具體作用尚需要進一步研究。

綜上所述，GDM孕婦mtDNA T16189C變異頻率顯著升高，該位點變異是GDM發生的危險因素，攜帶mtDNA T16189C變異的GDM孕婦的胰島素抵抗更嚴重。雖然mtDNA T16189C變異的致病機制尚不明確，但其作為GDM發生的風險基因，攜帶該變異位點的孕婦需加強妊娠期管理，嚴格控制血糖和體質量，預防GDM的發生。