國產某品牌谷胱甘肽還原酶試劑盒多中心橫向聯合性能評價

朱宇清，王海濱，王連明，趙 芳，馮品寧，張 鵬，郭書忍，彭亦冰，程黎明，傳良敏0，王華梁

（1.上海市臨床檢驗中心臨床生化免疫學研究室，上海 200126；2.中國人民解放軍總醫院檢驗醫學中心，北京 100039；3.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150001；4.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，北京 100730；5.中山大學附屬第一醫院檢驗科，廣東 廣州 510080；6.南方醫科大學南方醫院檢驗科，廣東 廣州 510515；7.鄭州大學第一附屬醫院檢驗科，河南 鄭州 450052；8.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025；9.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，湖北 武漢 430030；10.四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072）

谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）是人體氧化還原體系中最重要的酶之一，是維持細胞中還原型谷胱甘肽含量的主要黃素酶。在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的參與下，氧化型谷胱甘肽會轉化為還原型谷胱甘肽，后者在防止血紅蛋白的氧化分解、維持巰基蛋白的活性、保證巰基蛋白的還原性及細胞的完整性等方面發揮重要作用[1]。GR可用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、慢性腎功能衰竭、糖尿病、心腦血管疾病等多種疾病的輔助診斷[2-5]，也可用于腫瘤化療藥物的耐藥性觀察[6]。近年來的研究結果表明，GR水平升高與多種肝臟疾病相關，可作為臨床診斷、評估肝損傷的輔助指標，對于肝臟損傷具有較好的預警作用[7]。

目前，GR活性檢測已被廣泛應用于臨床，檢測方法以紫外酶法為主，以氧化型谷胱甘肽為底物，在GR的催化作用下生成還原型谷胱甘肽，同時將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化成氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，通過檢測還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的下降速率來測定GR活性。

本研究在全國范圍內采用多中心橫向聯合評價的方法，對江西樂成公司GR檢測試劑盒進行了性能評價。所有參與評價的實驗室必須在相同的時間，按照統一的評價方案，使用相同批號試劑，對同一批標本進行測試和評估，最終匯總所有實驗室的檢測結果進行橫向比較和綜合評價，從而實現了對該品牌GR檢測試劑的檢測性能進行全方位、多維度的評價。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取我國不同地區9家三級甲等綜合性醫院臨床實驗室[中國人民解放軍總醫院（301）檢驗醫學中心、哈爾濱醫科大學附屬第一醫院檢驗科、中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科、中山大學附屬第一醫院檢驗科、南方醫科大學南方醫院檢驗科、鄭州大學第一附屬醫院檢驗科、上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科、華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科、四川省人民醫院檢驗科]，組成多中心聯合評價小組，同步進行該品牌谷胱甘肽還原酶（GR）試劑盒檢測性能評價。

1.2 儀器和試劑

9家臨床實驗室使用的全自動生化分析儀包括cobas c701 全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）3臺、ARCHITECT c16000全自動生化分析儀（美國雅培公司）2臺、AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）4臺。江西樂成公司谷胱甘肽還原酶（紫外酶法）檢測試劑盒（批號20190426、20190118、20190308）、配套校準品（批號20190320、20190413）和質控品（批號20190320、20190413），英國朗道公司谷胱甘肽還原酶（紫外酶法）檢測試劑盒及配套校準品（批號450780）。

1.3 方法

所有檢測標本均為無溶血、黃疸、脂血的臨床剩余血清。多中心聯合評價小組按照統一的評價方案，使用各自實驗室生化分析儀、江西樂成公司GR試劑和校準品組成的被評價檢測系統進行實驗。所使用的江西樂成公司GR試劑、校準品、質控品和英國朗道公司GR試劑均為相同批號。用于線性范圍、最大稀釋倍數和比對試驗的血清樣品均為相同的分割樣品。實驗時間嚴格控制在2019年7月8—12日，5 d內全部完成。

1.3.1 重復性 參照《CNAS-GL037 臨床化學定量檢驗程序性能驗證指南》[8]的建議，檢測低（L1）、中（L2）、高（L3）3個濃度非定值質控品，在1批內分別連續檢測20次，計算檢測結果的均值（）、標準差（s）、變異系數（coefficient of variation，CV）。重復性（CV）小于室間質量評價（external quality assessment，EQA）標準的1/4（5%），則驗證通過。分別計算3個濃度質控品所有實驗室重復性（CV）的。

1.3.2 室內精密度 參照《WS/T 492—2016臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》[9]建議的精密度驗證方案，用同一批試劑檢測低（L1）、中（L2）、高（L3）3個濃度非定值質控品，每天檢測3次，連續測5 d，計算批內標準差（sr）、批間標準差（sb），實驗室內標準差（s）和實驗室內CV。實驗室內CV小于EQA標準的1/3（6.67%），則驗證通過。分別計算3個濃度質控品所有實驗室內CV的。

1.3.4 線性范圍 取已知濃度的高（H）、低（L）值樣品各1份，按5L、1H+4L、2H+3L、3H+2L、4H+1L、5H配制成6個濃度系列樣品，分別重復檢測3次。參照《WS/T 408—2012 臨床化學設備線性評價指南》[11]建議的方案進行統計，剔除離群值后，將檢測結果進行一次、二次和三次多項式回歸分析，對非線性系數進行t檢驗，判斷非線性系數與“0”是否有顯著性差異。如果二次和三次多項式的非線性系數與“0”無顯著性差異，則數據組被認為具有線性，此時可對數據組進行精密度檢驗，精密度符合線性判斷要求時，可確定數據組具有統計學線性或一階線性；如果非線性系數與“0”具有顯著性差異，則進行非線性程度判斷和精密度檢驗。計算最優擬合曲線與直線的平均差異值（average deviation from linearity，ADL），將ADL與臨界值[11]進行比較，ADL小于臨界值，則判定為臨床可接受的非線性，即二階線性；反之則判定為非線性。

1.3.5 最大稀釋倍數 使用高值血清樣品，按照廠家推薦的樣品最大稀釋倍數進行稀釋，本研究為5倍稀釋。稀釋后，在1批內重復檢測3次，計算，并以×稀釋倍數后的值作為實際值，計算回收率，計算公式為：回收率=實際值/理論值×100%，以（100±10）%為可接受范圍[12]。

1.3.6 偏移評估 參照文獻[9]，使用患者樣品的正確度驗證方案，以各實驗室的生化分析儀、英國朗道公司GR試劑和校準品組成對照檢測系統，進行比對試驗。分別使用被評價檢測系統和對照檢測系統檢測40份血清樣品。樣品濃度按試劑盒檢測線性范圍平均分布。計算被評價檢測系統與對照檢測系統之間配對結果的偏移。將數據進行配對t檢驗，確定不同系統間的平均偏移以及偏移的s。若偏移小于EQA標準的1/2（10%），則驗證通過；否則，計算偏移驗證值，若偏移在偏移驗證值范圍內，則驗證通過。

1.3.7 試劑間比較 分別使用被評價檢測系統和對照檢測系統檢測40份血清樣品，將所有實驗室的檢測結果按照試劑分成國產試劑組和進口試劑組。分別比較國產試劑組和進口試劑組組內9家實驗室檢測結果的一致性，使用SPSS 25.0軟件分別對9家實驗室的檢測結果進行Kendall相關性檢驗，Kendall協調系數為0.8～1.0表示極強相關，0.6～0.8表示強相關，0.4～0.6表示中等程度相關，0.2～0.4表示弱相關，0.0～0.2表示極弱相關或無相關。分別計算40份血清樣品國產試劑組和進口試劑組的組內、s和CV，對組內和CV進行配對t檢驗，并進行相關分析。

1.3.8 儀器間比較 將40份血清樣品檢測結果按照試劑分為進口試劑組和國產試劑組，然后分別在2個試劑組內按照儀器品牌分為A、B、C 3個組。計算各儀器組內40份血清樣品檢測結果的、實驗室間CV，對不同儀器組檢測結果的進行兩兩配對t檢驗，比較相同試劑在不同儀器平臺的檢測結果之間的差異。

2 結果

2.1 重復性評價結果

各實驗室檢測低（L1）、中（L2）、高（L3）3個水平質控品的重復性（CV）均小于EQA標準的1/4（5%），9家實驗室3個濃度質控品的平均CV分別為2.83%、2.42%、1.28%。見表1。

表1 重復性評價結果 %

2.2 室內精密度評價結果

各實驗室檢測低（L1）、中（L2）、高（L3）3個水平質控品的實驗室內CV均小于EQA標準的1/3（6.67%），9家實驗室3個濃度質控品的平均CV分別為3.15%、3.44%、2.07%。見表2。

表2 室內精密度評價結果 %

2.3 試劑批間差

6號實驗室低濃度（L1）樣品相對偏差為11.6%，9號實驗室中濃度（L2）樣品的相對偏差為10.1%，其余實驗室各濃度水平相對偏差均小于廠家聲明（8%）。將所有實驗室檢測數據匯總后計算得到L1、L2、L3質控品的總體批間差分別為2.8%、0.5%、0.6%。見表3。

表3 試劑批間差評價結果 %

2.4 線性范圍

在廠家聲明的線性范圍（10～320 U/L）內，3號、8號實驗室最優擬合方程為二階方程，7號實驗室最優擬合方程為三階方程，線性偏移均小于EQA標準的1/4（5%）；其余實驗室最優擬合方程均為一階方程。所有實驗室的相關系數（r）為0.997～1.000。見表4。

表4 線性范圍驗證結果

2.5 最大稀釋倍數

將高值樣品進行5倍稀釋后進行檢測，9家實驗室的回收率分別為101.1%、100.9%、92.6%、106.3%、93.4%、103.4%、98.5%、97.4%、94.6%，平均回收率為98.7%，結果均在允許范圍內。

2.6 偏移評估

9家實驗室40份樣品比對結果顯示，偏移均小于EQA標準的1/2（10%），r值為0.997～1.000。見表5。

表5 偏移評估結果

2.7 試劑間比較結果

國產試劑組9家實驗室檢測結果呈中等程度相關，Kendall協同系數為0.471（P<0.01）；進口試劑組9家實驗室檢測結果呈較強相關，Kendall協同系數為0.633（P<0.01）。40份血清樣品國產試劑組與進口試劑組的組內CV差異無統計學意義（P>0.05）；國產試劑組平均CV為6.48%，進口試劑組平均CV為6.68%。40份血清樣品國產試劑組與進口試劑組的組內差異無統計學意義（P>0.05）；以英國朗道公司GR試劑檢測結果為X，以江西樂成公司GR試劑檢測結果為Y，進行相關性分析，結果顯示，2種試劑相關性良好（r=1.000，P<0.01）。見圖1。

圖1 2種GR試劑檢測結果相關性

2.8 儀器間比較結果

國產試劑A儀器組與B、C儀器組檢測結果差異均無統計學意義（P>0.05），B儀器組與C儀器組檢測結果差異有統計學意義（P<0.05）。進口試劑組A儀器與B儀器組檢測結果差異無統計學意義（P>0.05），C儀器組與A、B儀器組檢測結果差異均有統計學意義（P<0.05）。見表6。

表6 儀器間比較

3 討論

近年來，在國家層面相關科技計劃的大力支持下，我國自主體外診斷領域已具備較好的產品研發基礎，試劑創新與研制鏈已基本形成。傳染病、腫瘤、心腦血管疾病、優生優育、代謝性疾病、內分泌疾病等系列國產診斷試劑已在臨床廣泛應用，部分試劑檢測性能已達到或接近國際同等水平[13]。本研究在全國范圍內聯合多家三級甲等綜合性醫院實驗室對國產試劑進行多中心橫向聯合性能評價，根據《CNAS-CL02-A003醫學實驗室質量和能力認可準則在臨床化學檢驗領域的應用說明》[14]，并參考相關衛生行業標準對江西樂成公司GR檢測試劑的重復性、室內精密度、試劑批間差、線性范圍、最大稀釋倍數等性能進行了驗證。新版《CNAS-CL02-A001 醫學實驗室質量和能力認可準則的應用要求》已于2021年05月25日發布，2021年11月25日開始實施，本研究開始進行此項評估時，新版要求還未發布，故本研究評價方案參照的是舊版本的文件[14]，并且關于重復性精密度低于EQA標準的1/4，室內精密度低于EQA標準的1/3的要求，只在當時評估方案所采用的舊版本文件中才有要求，新版文件已無此要求。

本研究參照文獻[8-9]要求，采用同一批試劑每天檢測低（L1）、中（L2）、高（L3）3個濃度非定值質控品，驗證重復性（在1批內分別連續檢測20次）和室內精密度（每天檢測3次，連續測5 d），結果顯示，9家實驗室重復性（CV）均小于EQA標準的1/4（5%），室內精密度（CV）均小于EQA標準的1/3（6.67%）。

試劑批間差評價結果顯示，有1家實驗室中濃度（L2）樣品批間差超出了廠家聲明。經過該實驗室分析發現，用于批間差檢測的主、副試劑開瓶日期不同步，主試劑于2019年7月8日開瓶，副試劑于2019年7月17日開瓶；另外，主、副試劑并未在同一時間段內進行定標，校準品7月8日復溶后用于主試劑定標，已復溶的校準品在冰箱內冷藏保存9 d后用于副試劑定標。按照廠家說明，校準品復溶后在2～8℃條件下穩定24 h。因此，該實驗室試劑批間差結果不符合可能是不同批號試劑開瓶、定標不同步，以及副試劑定標所用校準品已過開瓶有效期所致。另有1家實驗室的低濃度（L1）樣品批間差超出廠家聲明的允許范圍。綜合統計所有實驗室的檢測結果，3個濃度（L1、L2、L3）樣品試劑總體的批間差均符合要求，試劑批間差性能基本滿足要求，但仍有待進一步提高。

本研究中，有3家實驗室線性范圍評價驗證結果的最適擬合多項式為二次多項式或三次多項式，統計學上為非線性，但是其ADL均小于臨界值，故驗證結果為臨床可接受的非線性，即二階線性。目前，GR項目既無參考測量程序，也無國際公認的有證參考物質，因此在本次聯合評價中，我們參考了目前實驗室普遍采用的衛生行業標準文件——《WS/T 492—2016 臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》[9]（此文件相當于CLSI EP15-A2文件，最新版的CLSI EP15-A3目前還沒有相對應的行業標準），使用患者樣品進行偏移評估的方案。選用英國朗道公司GR試劑作為參比試劑進行比對。所有實驗室國產試劑和進口試劑檢測結果相關性良好，偏移均在允許范圍內，說明國產試劑與進口試劑具有可比性。

根據《CNAS-CL02 醫學實驗室質量和能力認可準則》[15]的要求，在常規應用前，應由實驗室對檢驗程序進行獨立驗證，證實檢驗程序的性能指標。本研究中，9家實驗室的驗證結果顯示，所評價的國產GR檢測試劑盒的各項檢測性能指標均達到了預期。多中心橫向聯合評價不僅可反映檢測系統在單個實驗室內的性能，還可以橫向比較檢測試劑測定結果在不同實驗室之間的差異。本研究規定9家實驗室在相同時間按照相同方案進行實驗，使用的試劑、校準品、質控品均為同一批號，血清樣品相同，即將每份樣品平均分裝成9份后分發到各實驗室，因此9家實驗室的檢測結果具有一定的橫向可比性。本研究將所有實驗室的檢測結果按照試劑品牌分組進行統計，結果顯示國產試劑組和進口試劑組組內9家實驗室的檢測結果均具有顯著的相關性，說明不同試劑組組內檢測結果一致性較好；國產試劑和進口試劑的組內CV差異無統計學意義，說明國產試劑組實驗室間的精密度與進口試劑組一致；國產試劑檢測結果與進口試劑檢測結果無明顯差異，且結果具有顯著相關性，說明國產試劑檢測結果與進口試劑檢測結果具有良好的一致性；儀器間比較結果顯示，無論是國產試劑，還是進口試劑，在不同儀器平臺的檢測結果均存在一定差異，說明不同儀器平臺之間存在一定的系統誤差，提示廠家應根據不同儀器平臺調整校準品賦值，以提高檢測結果的一致性。

多中心橫向聯合評價作為一種全新的理念和評價方式，在不同地域、不同設備、不同環境、不同操作人員的條件下，使用同一樣品在同一時間節點進行性能驗證，是一種全新的嘗試與探索。于臨床實驗室而言，參與多中心橫向聯合評價可以客觀、全面地了解產品的綜合性能，多中心橫向聯合評價的數據也有助于實驗室對體外診斷試劑進行更加客觀的了解；于患者而言，使用多中心橫向聯合評價通過的體外診斷試劑，在不同地域、不同醫院、不同檢測儀器條件下均能獲得可比較的檢測結果；于體外診斷研發企業而言，多中心橫向聯合評價有助于其了解試劑在不同檢測系統上的差異，幫助其完善溯源體系，在不同檢測系統上對校準品的賦值進行調整；于國家而言，多中心橫向聯合評價有益于推動我國民族企業體外診斷產品的品質提升，讓國產體外診斷產品在市場上更具競爭力，惠及民族企業、醫院與廣大患者。同時，多中心橫向聯合評價也可為實現更大區域內的檢驗結果互認提供真實世界的數據，為促進這一政策的有效落地提供更切合實際的參考。

（本研究為多中心研究，所有作者對本研究具有同等貢獻，作者排名按數據上報時間排序。）