miR-19b在人主動脈瓣間質細胞鈣化中的作用

楊 濛，丁 輝

（西北大學附屬醫院 西安市第三醫院心血管內科，陜西 西安 710018）

鈣化性主動脈瓣疾病是與老年人心血管疾病密切相關的一種退行性疾病[1]。有研究發現，主動脈瓣膜鈣化是類似成骨樣分化的主動過程，涉及多個成骨相關因子的表達調節[2]。主動脈瓣間質細胞是主動脈瓣中的主要細胞之一，在維持瓣膜正常生理功能方面有重要作用[3]。在疾病的刺激下，主動脈瓣間質細胞可能發生功能受損，從而導致主動脈瓣膜病變的發生[4]。主動脈瓣間質細胞向成骨細胞樣細胞表型的轉化是主動脈瓣鈣化病理改變的基礎之一[4]。miRNA參與了人體的多種生理和病理過程，如細胞增殖、凋亡和分化[5]。有研究結果顯示，miR-19b的低表達與心血管疾病患者的死亡率密切相關[6]。但miR-19b在主動脈瓣鈣化疾病中的相關研究鮮有報道。為此，本研究擬探討miR-19b在主動脈瓣間質細胞鈣化中的作用及具體機制，為臨床主動脈瓣鈣化疾病的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

infinite M200 PRO多功能酶標儀（瑞士TECAN公司），StepOnePlus實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），AgaroPower電泳儀（韓國BIONEER公司）。

人主動脈瓣間質細胞（human valve interstitial cell，hVIC）購自美國DV公司。胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、地塞米松、抗維生素C和β-甘油磷酸均購自美國Sigma公司。Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrigen公司。Von Kossa染色試劑盒及SMAD4抗體均購自美國Abcam公司。RNA逆轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）和雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒均購自日本TaKaRa公司。miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成轉錄受體相關轉錄因子-2（Runt-related gene 2，RUNX2）基因、骨鈣素（osteocalcin，OC）基因、SMAD1基因、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因和SMAD4基因的引物序列，見表1。以β-actin或U6為內參。miR-19b模擬物、miR-19b空白對照（miRNC）及SMAD4過表達質粒設計及合成由漢尹生物科技（上海）有限公司完成。一抗[SMAD4抗體（貨號：ab40759）、抗3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（貨號：ab9485）]及二抗（貨號：ab6759）均購自英國Abcam公司。聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Millipore公司。

表1 引物序列

1.2 實驗分組

將經鈣化誘導的hVIC細胞作為鈣化模型組，以未做處理的hVIC細胞作為對照組。根據轉染質粒的不同，將hVIC細胞分為miR-19b空白對照組，miR-19b過表達組、SMAD4過表達組、miR-19b和SMAD4同時過表達（miR-19b+SMAD4過表達）組。

1.3 細胞培養

對照組hVIC細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養。鈣化模型組hVIC細胞用含0.1%胎牛血清、50 ng/mL BMP-2、100 nmol/L地塞米松、50 μg/mL抗維生素C和5 mmol/L β-甘油磷酸的DMEM培養，每隔2天更換1次培養基[7-8]。所有細胞均在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行培養，培養7 d后進行后續實驗。

1.4 細胞轉染

將hVIC細胞以3×104個細胞/孔的密度接種至6孔板，當細胞融合度為80%時，使用30 pmol miR-19b模擬物或2.5 μg SMAD4過表達質粒，根據Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉染hVIC細胞。轉染48 h后采用熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測轉染效率。

1.5 Von Kossa染色

去除對照組和鈣化模型組hVIC細胞的培養基后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3次；用4%多聚甲醛固定10 min，隨后使用蒸餾水洗滌3次；將hVIC細胞浸入新配置的5%硝酸銀溶液中，紫外燈照射60 min后使用5%硫代硫酸鈉還原2 min；用95%乙醇逐級各脫水2次，在CX23型光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下用低倍鏡觀察，記錄各組hVIC細胞中鈣化結節的數目。

1.6 熒光定量PCR

常規提取各組hVIC細胞內的總RNA，逆轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA）（mRNA采用RNA逆轉錄試劑盒，miRNA采用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒）。采用熒光定量PCR定量檢測RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA、OPN mRNA、SMAD4 mRNA和miR-19b的表達量。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環。根據公式2-ΔΔCt計算RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA、OPN mRNA、SMAD4 mRNA及miR-19b的表達量。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

通過StarBase數據庫（https：//starbase.sysu.edu.cn）在線預測miR-19b的下游靶基因。采用PCR擴增SMAD4 mRNA 3'-非翻譯區（untranslated region，UTR），插入psiCHECK2載體，構建野生型（wide-type，WT）質粒，以WT質粒為模板，通過點突變的方式構建突變型（mutanttype，Mut）質粒。將hVIC細胞以3×103個細胞/孔的密度接種至96孔板，當細胞融合度為80%時，轉染miR-NC、miR-19b-mimics、psiCHECK2-SMAD4-WT或psiCHECK2-SMAD4-Mut，轉染后48 h在各孔中加入100 μL裂解液并離心。收集各孔上清液后，加入40 μL螢火蟲熒光素酶底物，輕晃搖勻后上機檢測熒光強度。再向各孔中加入40 μL海腎熒光素酶底物，輕晃搖勻后測量各孔的熒光素酶活性。

1.8 免疫印跡法

采用RIPA裂解液分離hVIC細胞內的總蛋白。將蛋白質混合物95 ℃加熱10 min。將20 μL加熱后的蛋白質混合物加入聚丙烯酰胺凝膠平板中，電泳分離蛋白質。將電泳后的蛋白質轉移至PVDF膜上，在4 ℃條件下與SMAD4一抗封閉過夜，采用三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液（tris-hydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）洗滌3次后加入二抗，在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒（美國ThermoFisher Scientific公司）進行顯影后拍照，使用Image J軟件（美國國立衛生研究院）分析條帶灰度值。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。采用GrapahPad 8.2軟件作圖。所有實驗均獨立重復3次。呈正態分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人主動脈間質細胞體外鈣化模型構建

鈣化模型組hVIC細胞密度增加，互相重疊生長，并表現出明顯的聚集樣生長趨勢。Von Kossa染色結果顯示，鈣化模型組hVIC細胞外基質中鈣化結節的數目明顯多于對照組。熒光定量PCR檢測結果顯示，鈣化模型組hVIC細胞內成骨相關因子RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA和OPN mRNA的相對表達量顯著高于對照組（P<0.05）。見圖1。

圖1 hVIC細胞體外鈣化模型

2.2 miR-19b對hVIC細胞鈣化的作用

鈣化模型組miR-19b表達量（0.46±0.06）顯著低于對照組（1.00±0.10）（t=8.020，P<0.01），miR-19b過表達組（2.46±0.21）顯著高于對照組（t=10.870，P<0.001）。

miR-19b過表達組hVIC細胞內成骨相關因子RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA及OPN mRNA表達量顯著低于鈣化模型組（P<0.05、P<0.01、P<0.01、P<0.01）。見表2。

表2 miR-19b過表達組與鈣化模型組成骨相關因子表達的比較

2.3 miR-19b下游靶基因的預測結果

StarBase數據庫預測結果顯示，SMAD4與miR-19b的3'-UTR端存在部分結合序列，見圖2。

圖2 miR-19b與SMAD4的結合序列

miR-19b過表達組SMAD4蛋白的表達量（0.42±0.04）和野生型SMAD4熒光素酶活性（0.53±0.05）均顯著低于miR-NC組（1.00±0.14和1.00±0.11）（t值分別為6.900、6.737，P<0.01）；而miR-19b過表達組突變型SMAD4熒光素酶活性（0.97±0.06）與miRNC組（1.00±0.07）比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 miR-19b過表達組與miR-NC組SMAD4蛋白相對表達量及SMAD4熒光素酶活性比較

2.4 miR-19b/SMAD4分子軸在人主動脈瓣間質細胞鈣化中的作用

鈣化模型組、SMAD4過表達組SMAD4 mRNA相對表達量分別為1.46±0.09、3.15±0.17，均顯著高于對照組（1.00±0.10）（t值分別為5.922、18.881，P<0.001），miR-19b+SMAD4過表達組SMAD4 mRNA水平與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

SMAD4過表達組RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA和OPN mRNA的相對表達量顯著高于鈣化模型組和miR-19b+SMAD4過表達組（P<0.05），而鈣化模型組與miR-19b+SMAD4過表達組之間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組成骨相關因子表達的比較

3 討論

目前，除了傳統的手術治療外，尚無其他方法可阻止主動脈瓣鈣化的發生、發展。有研究證實，炎癥反應、主動脈瓣間質細胞表型轉化、凋亡、血管形成和礦物質沉積等多種病理改變在主動脈瓣鈣化疾病中發揮重要作用[9]。

成骨細胞特異性轉錄因子RUNX2、SMAD1是多種成骨細胞和骨組織標志物，其水平升高提示主動脈瓣鈣化[10]。有研究結果顯示，主動脈瓣間質細胞向成骨細胞表型轉化是主動脈瓣鈣化疾病的發病原因之一[11]。本研究通過體外培養主動脈瓣間質細胞，誘導其發生鈣化，在顯微鏡下可觀察到細胞聚集生長，采用Von Kossa染色后發現鈣化結節數量增多，同時細胞轉錄因子RUNX2、OC、SMAD1及Osteoponin水平增高，提示鈣化模型成功建立。

miRNA是一類具有重要生物學功能的內源性非編碼小RNA。有研究發現，miR-137可調節主動脈瓣間質細胞的成骨活性[12-13]。有研究結果顯示，在小鼠主動脈鈣化模型中，miR-204表達降低，RUNX2表達升高，提示miR-204是主動脈鈣化疾病的潛在治療靶標[14]；miR-638在主動脈瓣鈣化組織中表達增加，且具有調節主動脈瓣間質細胞鈣化的作用[15]。miR-19b是近年來發現與心臟疾病密切相關的miRNA之一[16-17]，但其在主動脈瓣鈣化疾病中的作用鮮有報道。本研究結果顯示，鈣化模型組miR-19b表達量明顯降低，過表達miR-19b可誘導鈣化模型細胞降低RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA和OPN mRNA的表達，提示miR-19b表達的異常缺失可能是導致主動脈瓣鈣化疾病的因素之一。有學者在骨髓間充質干細胞中發現miR-19b過表達可誘導RUNX2表達增加，促進細胞增殖與分化[18]。然而，本研究在主動脈瓣間質細胞中發現，過表達miR-19b可抑制RUNX2表達，這與既往在其他細胞系中的發現[18]相反，提示miR-19b具有細胞表達特異性及功能的差異。此外，既往支持miR-19b調控OC、SMAD1和OPN基因表達的研究尚少，因此miR-19b的調控作用仍需進一步研究。

有研究發現，BMP-2/SMAD信號通路與間質細胞的成骨分化密切相關，SMAD4是其中的關鍵調節蛋白[19]。SMAD4蛋白可以與磷酸化的SMAD1、SMAD5或SMAD8結合形成復合物，增加下游鈣化基因的表達。HUANG等[20]的研究結果顯示，SMAD4是成骨細胞分化的關鍵調節因子之一。本研究結果顯示，過表達SMAD4可使間質細胞模型成骨相關因子RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA和OPN mRNA相對表達量明顯升高，熒光素酶報告基因實驗結果證實SMAD4是miR-19b的下游靶基因。JIANG等[21]通過基因數據庫預測及熒光素酶報告基因分析，在結腸癌細胞中發現miR-19b可靶向SMAD4并抑制其表達，與本研究結果一致。這明確了miR-19b與SMAD4的靶向作用，而過表達miR-19b可抑制SMAD4的表達。因此，當hVIC同時過表達miR-19b和SMAD4時，過表達miR-19b逆轉了過表達SMAD4對鈣化模型細胞內成骨相關因子表達的上調。

綜上所述，miR-19b是hVIC鈣化的關鍵調節因子，可通過調節SMAD4蛋白的表達影響主動脈瓣間質細胞鈣化，提示miR-19b和SMAD4有可能成為治療主動脈瓣鈣化疾病的潛在靶標。