湖羊SREBP1基因編碼區序列克隆及表達分析

李樊 舒嘉傲 李隱俠 孟春花 張晨儉 張俊 錢勇 曹少先

摘要： SREBP1是一個重要的核轉錄因子，參與調控膽固醇和脂肪酸等合成和代謝，本研究旨在基于獲得湖羊SREBP1基因序列并分析其組織表達譜和卵巢中的表達定位，了解其在湖羊中可能的生物學功能。本研究利用RT-PCR技術對周歲湖羊卵巢組織中SREBP1基因編碼區序列進行克隆和測序，用生物信息學軟件對序列進行拼接、同源比對和功能預測分析，熒光定量PCR檢測其在湖羊組織中的表達模式，免疫組織化學染色法鑒定其在卵巢組織中的定位。結果顯示：SREBP1基因在湖羊卵巢組織中有2種剪接體，對應編碼區長度分別為3 369 ?bp和3 441 ?bp，分別編碼1 122 個和1 146 個氨基酸殘基;SREBP1在哺乳動物中相對保守，含有經典的bHLH-Zip結構域，通過識別E-boxes或者固醇調節元件調控靶基因的表達;組織表達譜分析結果顯示，SREBP1在湖羊組織中廣泛表達，提示SREBP1基因可能參與調控湖羊多種生物學過程。免疫組織化學染色法分析結果顯示，SREBP1基因在湖羊卵巢腔前卵泡和有腔卵泡中均有表達，主要定位于顆粒細胞、卵泡膜細胞和黃體細胞中，推測SREBP1可能在湖羊繁殖調控中發揮重要的作用。這些結果為進一步研究湖羊SREBP1基因的功能提供了基礎。

關鍵詞： SREBP1; 克隆; 序列特征; 湖羊

中圖分類號： S858.26?? 文獻標識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2022）03-0721-09

Sequence cloning and expression analysis of SREBP1 gene in ?Hu ?sheep

LI Fan 1，2 ， SHU Jia-ao 2 ， LI Yin-xia 2 ， MENG Chun-hua 2 ， ZHANG Chen-jian 2 ， ZHANG Jun 2 ， QIAN Yong 2 ， ?CAO Shao-xian 1，2

（1.College of Animal Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China; 2.Institute of Animal Science， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：? SREBP1 is an important nuclear transcription factor， which is involved in regulating the synthesis and metabolism of cholesterol and fatty acids and other biological functions. The purpose of this study is to understand the possible biological functions of SREBP1 gene in ?Hu ?sheep based on its coding sequence， tissue expression profile and location in ovary. In this study， the coding region of SREBP1 gene in ?Hu ?sheep ovarian tissue was cloned and sequenced by RT-PCR. Bioinformatics software was used for splicing， homologous alignment and functional prediction analysis. The expression pattern in ?Hu ?sheep tissue was detected by real-time PCR， and its localization in ovarian tissue was identified by immunohistochemistry. The results showed that SREBP1 gene had two kinds of spliceosomes in ?Hu ?sheep ovary， and the length of corresponding coding regions was 3 369 ?bp and 3 441 ?bp， and encoding 1 122 ?and 1 146 ?amino acid residues， respectively. SREBP1 was relatively conserved in mammals and contained the classical bHLH-Zip domain. In addition it could regulate the expression of target genes by identifying E-boxes or sterol regulatory elements. The results of tissue expression profile analysis showed that SREBP1 was widely expressed in ?Hu ?sheep， suggesting that SREBP1 gene may be involved in regulating a variety of biological processes in ?Hu ?sheep. The results of immunohistochemical staining showed that SREBP1 gene was expressed in both antral follicles and preantral follicles of ?Hu ?sheep ovary， mainly located in granulosa cells， theca cells and luteal cells， suggesting that SREBP1 may play an important role in the reproductive regulation of ?Hu ?sheep. These results provide a basis for further study on the function of SREBP1 gene in ?Hu ?sheep.

Key words： SREBP1; clone; sequence characteristics; ?Hu ?sheep

固醇調節元件結合蛋白（Sterol regulatory element binding protein， SREBP）是機體內重要的核轉錄因子家族，參與調控膽固醇和脂肪酸的合成，對維持動物體內脂質代謝穩態至關重要 [1-3] 。SREBP屬于螺旋-莖環-螺旋亮氨酸拉鏈（Basic-loop-helix-leucine zipper，bHLH-Zip）家族，由3個結構域組成，分別包含由1個反式激活區域、1個富含脯氨酸的區域和bHLH-Zip結構域組成的NH2 端，2個疏水跨膜片段和1個COOH末端結構域 [4] 。SREBP一般在內質網合成之后被運輸到高爾基體，在高爾基體中依次經過蛋白酶 S1 P 和 ?S2 P 水解，從膜中釋放出NH2 末端結構域然后異位到細胞核，在細胞核內作為轉錄因子與靶基因的啟動子結合從而激活相關基因的轉錄 [5] 。

SREBP 主要包括SREBP1和SREBP2 2個基因，其中SREBP1在哺乳動物中有2種亞型：SREBP1A和SREBP1C [6] 。研究結果顯示，SREBP1A主要參與調控膽固醇、脂肪酸和甘油三酯合成，而SREBP1C更能促進與脂肪酸相關基因的轉錄 [7] 。截至目前，人、小鼠、山羊和雞中的SREBP1A和SREBP1C 2個基因亞型的序列及功能差異已有報道 [8-11] ，但在綿羊中鮮見研究。本研究以江蘇省特色綿羊品種——湖羊為研究對象，擴增湖羊卵巢組織中SREBP1基因編碼區序列并進行序列特征分析，鑒定其在湖羊各個組織中的表達模式和在卵巢組織中的定位，為進一步研究該基因在綿羊中的功能及調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗羊為3只健康狀況良好的周歲湖羊母羊，來自江蘇西來原生態農業有限公司，體質量（33.0± 1.6） kg，屠宰后立即采集心、肝、脾、腎、大腸、小腸、卵巢、子宮和肌肉等，樣品分成2份，1份置液氮中帶回實驗室，存放于-80 ℃ 備用，1份放入4%多聚甲醛中固定備用。

1.2 RNA提取和逆轉錄

參照動物組織總RNA提取試劑盒（百泰克生物技術有限公司產品，北京）說明書提取湖羊各組織樣品RNA，Nandrop分光光度計測定RNA質量和濃度，逆轉錄試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司產品，南京）將mRNA逆轉錄為cDNA，反應體系：1 000 ?ng RNA，4 μl 4× g DNA wiper Mix，加RNase Free ddH2 O至16 μl，混合均勻，置于PCR儀上進行基因組DNA去除，程序為42 ℃ 2 min，隨后加入5× HiScript II qRT SuperMix II 4 μl吹打混勻，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將RNA逆轉錄為cDNA，置-20 ℃ 保存備用。

1.3 引物合成與PCR擴增

根據NCBI上綿羊SREBP1預測序列 （XM_027974784.2和XM_027974786.2），采用Primer Premier5.0軟件設計4對特異性引物P1～ P4，用于分段擴增湖羊SREBP1基因編碼區序列;設計SREBP1 Real-time PCR引物，以 β-actin 為內參基因進行湖羊各組織SREBP1基因表達譜的鑒定。引物由南京擎科公司合成，引物序列見表1。

RT-PCR反應體系為25.0 μl，其中含12.5 μl 2×? Taq ?master Mix，1.0 μl cDNA，上游和下游引物各1.0 μl，9.5 μl ddH2 O。反應條件為：預變性95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s變性，退火15 s （具體退火溫度見表1），72 ℃ 90 s，共35個循環;72 ℃ 5 min。

1.4 克隆測序

RT-PCR擴增獲得的片段經過膠回收試劑盒獲得純化的目的片段，將目的片段與pMD-19T載體充分混合，16 ℃連接30 min，連接液轉化DH5 α 感受態，涂布在LB板上，37 ℃過夜。挑取單克隆培養菌， PCR鑒定陽性的菌液送南京擎科公司測序。

1.5 湖羊SREBP1基因生物信息學分析

分段擴增、克隆測序得到的SREBP1序列用Lasergene和DNAMAN6.0軟件比對、拼接和翻譯。SREBP1基因開放閱讀框的預測采用NCBI的ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf）在線軟件進行。使用ExPASy數據庫在線工具（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）進行SREBP1氨基酸序列特征及蛋白質理化性質分析，采用SMART網站在線工具（http：//smart.embl-heidelberg.de）進行蛋白質功能域預測分析。

1.6 湖羊各組織中SREBP1基因的實時熒光定量PCR

以 β-actin 為內參基因，Real-time PCR檢測湖羊心、肝、脾、腎、大腸、小腸、卵巢、子宮和肌肉組織中SREBP1基因的表達水平。每20.0 μl反應體系中含2.0 μl cDNA，10.0 μl 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，上游引物和下游引物各0.4 μl，7.2 μl ddH2 O。反應條件為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環;最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個樣本重復3次。

1.7 湖羊卵巢組織的免疫組織化學染色

采用免疫組織化學檢測SREBP1在湖羊卵巢組織中的表達情況，具體操作如下：取4%多聚甲醛中固定36 h的湖羊卵巢組織，依次置于70%、80%、90%、95%、100%（體積比）頤乙醇中脫水，置于二甲苯中進行透明后，用石蠟包埋并切片（厚4 μm）。石蠟切片用二甲苯脫蠟，依次在逐步降低濃度的乙醇中水化處理，然后在檸檬酸三鈉溶液中高火熱修復10 min，自然冷卻，隨后3%的雙氧水敷育30 min，阻斷內源性過氧化氫酶，PBS充分漂洗3次，1次5 min，用10% BSA封閉1 h后，兔源抗SREBP1抗體（稀釋濃度：1∶ 100，體積比）4 ℃孵育過夜。PBS充分漂洗3次，1次 5 min，二抗（Abcam;稀釋濃度：1∶ 500）室溫孵育60 min，PBS充分漂洗3次，1次 5 min，DAB（Sigma-Aldrich）顯色劑顯色5 min，自來水沖洗終止染色，用蘇木精復染，用乙醇脫水并置于二甲苯中透明，中性樹膠封片。將切片置于顯微鏡下觀察，采集圖像，用imageJ軟件進行光密度值分析。

2 結果與分析

2.1 湖羊SREBP1基因克隆

根據NCBI上綿羊SREBP1預測序列，分段設計4對引物（圖1A），以湖羊卵巢組織cDNA為模板，擴增湖羊SREBP1基因編碼區全序列（圖1B），目的條帶清晰，片段大小與預測結果一致。回收擴增的目的條帶測序，發現與預測序列高度同源，說明獲得的序列為湖羊SREBP1編碼區序列。

2.2 湖羊SREBP1基因序列特征分析

將PCR擴增獲得的SREBP1分段序列進行拼接，得到SREBP1在湖羊卵巢組織中的2個剪接體，拼接好的2個序列用ORF Finder在線軟件分析SREBP1基因的開放閱讀框，預測對應編碼區長度分別為3 441 ?bp和3 369 ?bp，命名為SREBP1L和SREBP1S。DNAMAN比對結果顯示，擴增獲得的湖羊SREBP1L核苷酸序列與NCBI上綿羊預測SREBP1的剪接體X1 （XM_027974784.2）、X2 （XM_042255744.1）、X3 （XM_042255745.1）和X4 （XM_027974786.2） 編碼區的同源性分別為99.91%、96.89%、96.48%和96.81%，其中與X1編碼區的同源性最高，僅在c.1855T> C、c.2365A> C和c.2799A> C有3個突變，沒有插入和缺失;SREBP1S核苷酸序列與NCBI綿羊預測剪接體X1、X2、X3和X4編碼區的同源性分別為96.89%、100.00%、99.29%和94.05%，與X2編碼區序列完全一致。

以擴增獲得的湖羊SREBP1L序列為對象，與其他物種序列的同源性比對后發現，與人類（XM_024450894.1）、豬 （NM_214157.1）、小鼠 （NM_011480.4）、牛 （NM_001113302.1）、山羊 （NM_001285755.1） 和雞 （NM_204126.2）編碼區的同源性分別為83.79%、87.79%、78.88%、96.48%、98.88%和67.94%，與反芻動物牛和山羊的同源性較高，與禽類的同源性較低。

2.3 湖羊SREBP1蛋白氨基酸序列和結構分析

擴增獲得的湖羊SREBP1 2個剪接體序列分別編碼1 146 和1 122 個氨基酸殘基（SREBP1L和SREBP1S）（圖2）。氨基酸序列比對結果顯示，SREBP1L、SREBP1S氨基酸序列分別與小鼠SREBP1A（NP_035610 ）、SREBP1C（NP_001345243）的氨基酸序列同源性為79.40%、79.76%;與人的SREBP1A（NP_001375318）、SREBP1C（NP_001308025）的氨基酸序列同源性為85.03%、85.24%;SREBP1S氨基酸序列與SREBP1L氨基酸序列相比，僅在 N 端缺失了24個氨基酸殘基，這與小鼠、人SREBP1C相對于SREBP1A的 N 末端缺失24個氨基酸殘基類似，且在 N 端24個氨基酸殘基中，湖羊與小鼠的同源性為70.8%，與人類的同源性為83.3%（圖3）。

湖羊SREBP1L和SREBP1S編碼的蛋白質氨基酸序列中亮氨酸（Leu，L）的比例最高，分別為14.0%和13.8%，其次為丙氨酸（Ala，A），比例分別為12.6%和12.3%，二者均不含吡咯賴氨酸（Pyl，O）和硒半胱氨酸（Sec，U）（圖4）。

2.4 湖羊SREBP1蛋白理化性質

湖羊SREBP1基因編碼的2個蛋白質（SREBP1L和SREBP1S）預測相對分子質量分別為121 050.78 和118 550.99 ，理論等電點分別為8.81和9.16。預測正電荷氨基酸殘基數均為104個，負電荷氨基酸殘基數分別為93個和86個，體外半衰期均為30 h。SREBP1蛋白是一個疏水性蛋白，湖羊SREBP1基因編碼的2個蛋白質親/疏水性總和（ GRAVY ）分別為-0.099 和-0.106 。此蛋白質不存在信號肽，與其他物種的SREBP1蛋白一樣，湖羊SREBP1編碼的2個不同蛋白質均在 N 端有一段脯氨酸富集區域及典型的bHLH結構域（圖2）。

2.6 SREBP1基因在湖羊卵巢組織中的表達

湖羊卵巢組織經免疫組織化學染色后，其不同發育階段卵泡中均存在棕黃色陽性產物，結果顯示SREBP1在湖羊卵巢腔前卵泡和有腔卵泡中均有表達，主要定位于顆粒細胞、卵泡膜細胞和黃體細胞中（圖6），且SREBP1蛋白表達量無顯著差異（圖7）。

3 討 論

固醇調節元件蛋白SREBP1，1995年從人hela細胞核抽提物中分離并鑒定 [8] ，隨后，小鼠 [9] 、雞 [10] 和山羊 [11] 的 SREBP 序列被成功克隆，為后續SREBP1相關功能的研究提供了重要的基礎。SREBP1主要由2個亞型組成，SREBP1A和SREBP1C，序列差異主要在NH2 末端的24個氨基酸殘基，其他序列完全一致 [11] ，其核酸序列差異主要在啟動子區和第一外顯子區。本試驗通過PCR分段擴增和序列拼接獲得湖羊SREBP1基因編碼區全序列，分析發現擴增后獲得的2個SREBP1不同剪接體SREBP1L和SREBP1S。相對于SREBP1L，SREBP1S的氨基酸序列在NH2端有24個氨基酸缺失，其余的氨基酸序列完全一致，推測本研究中得到的SREBP1L和SREBP1S可能是湖羊SREBP1的2個亞型，SREBP1A和SREBP1C。

研究結果表明，SREBP1A主要參與膽固醇合成，而SREBP1C參與脂肪酸代謝。當細胞里的膽固醇供應充足時，SCAP（SREBP裂解活化蛋白）-SREBP復合物通過固醇原件結合蛋白裂解激活蛋白SCAP與胰島素調節蛋白INSIG結合形成SCAP-SREBPs-INSIG復合物嵌入內質網中 [3，12] 。當膽固醇水平變低或者膽固醇的需求變高時，SCAP與INSIG分離，SCAP-SREBP復合物易位到高爾基體，被高爾基體中的蛋白水解酶S1P加工，使SREBP與SCAP裂解，裂解后有活性的SREBP轉運到細胞核，激活膽固醇合成通路中關鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（ HMGCR ）基因或者脂肪合成關鍵基因（ LDLR ） ?[3] ，增加膽固醇和脂肪合成，調控機體內膽固醇和脂肪合成的穩態。進一步的研究發現，SREBP1中含有的bHLH-Zip結構域能與E-boxes（5′-CANNTG-3′） 和固醇調節元件（Sterol regulatory element， SRE） （5′-TCACNCCAC-3′）結合，調控靶基因表達，進而調控各種生物學過程 [13] 。本研究發現，湖羊SREBP1基因序列與哺乳動物SREBP1基因序列同源性較高，特別是與反芻動物同源性高達96.48%以上，說明SREBP1是比較保守的轉錄因子。氨基酸序列分析結果表明，與其他物種的SREBP1相似，湖羊SREBP1L和SREBP1S都含有經典的bHLH-Zip結構，與前人的研究結果一致 [13] 。

組織表達譜分析結果顯示，SREBP1在牛、雞等動物組織中廣泛表達，可能參與調控各種生物學進程 [14-16] ?。在HT29 細胞中過表達SREBP1導致 MMP7 表達量上調、激活NF-kappa B信號通路并促進結腸癌、直腸癌的侵襲 [17] 。在腎臟中，SREBP1激活TGF- β 信號，在腎纖維化中發揮重要的調控作用 [18] ;SREBP1與子宮內膜容受性相關聯 [19] 。湖羊組織表達譜顯示，SREBP1在湖羊的所有組織中均有表達，提示湖羊SREBP1參與多種組織生物學過程。但有研究結果顯示，SREBP1在牛的背最長肌中高表達，而本研究結果顯示其在湖羊肌肉組織中表達量最低，可能是因為背最長肌脂肪含量較高，與樣品采集的部位有關 [15] 。

包梅等 [20] 的研究結果顯示，SREBP1蛋白主要分布在牦牛乳腺腺泡上皮細胞、乳腺導管上皮細胞及血管內皮細胞，且SREBP1 mRNA表達量與牦牛泌乳量有關。而本研究的免疫組織化學染色結果發現，SREBP1在湖羊卵巢各級卵泡膜細胞、顆粒細胞和黃體細胞中均有表達，且研究發現SREBP1在卵巢組織中也發揮功能。多囊卵巢綜合征女性和子宮內膜癌女性子宮內膜的SREBP1 基因表達水平與正常女性相比顯著增加 [21] ，且SREBP1調控人的卵巢顆粒-黃體細胞中LHCGR（促黃體生成素受體）表達和孕酮水平 [22] 。提示SREBP1可能參與調控湖羊卵巢發育進而調控繁殖性能。

本研究獲得湖羊SREBP1基因2個剪接體，分別編碼SREBP1L和SREBP1S，含有經典的bHLH-Zip結構域。SREBP1在湖羊組織中廣泛表達，在湖羊卵巢各級卵泡均有表達，主要定位于顆粒細胞和黃體細胞中。這些結果為進一步研究湖羊SREBP1的生物學功能提供了線索。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-11-25

基金項目：江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX（20）3013];國家自然科學基金項目（31902155）

作者簡介：李 樊（1997-），女，湖北孝感人，碩士研究生，主要從事動物分子生物學研究。（E-mail）lf15205159110@163.com

通訊作者：曹少先， （E-mail）sxcao@jaas.ac.cn