絲素蛋白水凝膠支架的制備及其性能

李艾元，施心雨，岳萬福，游衛云

(浙江農林大學 動物科技學院·動物醫學院，浙江 杭州 311300)

20世紀70年代，支架工程已成為組織工程領域研究的熱點[1],支架工程的核心是模擬天然的細胞外基質[2]。基于生物學、工程學、醫學等原理設計出的組織工程支架可以適應不同組織的生物結構要求[2]。將組織工程與三維細胞培養、靜電紡絲等技術相結合，使得支架材料可以滿足：作為細胞的外基質使細胞增殖、分化[3-4]；不會與宿主發生免疫排斥反應[5]；人為控制降解速度，以滿足新組織的生長要求[6]；為細胞提供機械支撐，確保在植入前期給支架中的細胞提供必要的結構支持[7]；具有可控的處理體系[8]，面對不同的組織能夠提供可變的結構支撐。研發組織工程支架的目的是使受損組織可修復或者新生[9-10]。

與人工合成材料相比，絲素蛋白具有優異的力學性能和生物相容性，可適應不同組織的生長速度，在支架工程領域煥發新的光芒[11]。絲素蛋白有3種結構蛋白，包括絲素重鏈(2 390 ku)、輕鏈(226 ku) 和小糖蛋白P25(30 ku)[12]。絲素蛋白的重鏈具有兩親性，包含疏水塊和親水塊，其中疏水塊對絲素蛋白β折疊起重要作用[13]。然而與疏水區域相比，親水區域是一個較短且不重復的片段[14]，因此，絲素蛋白不能溶于水，但可被潛在的反應側基修飾，如醇、酚、胺、羧基等[15]。這種改性可引起絲素蛋白親水性和孔隙度的變化，實現可控的絲素蛋白支架制備[16]。為此，本文擬采用二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)來誘導脫膠絲素蛋白(SF)形成水凝膠，研究了不同濃度DMPG對支架材料的生物相容性、SF水凝膠支架凝結速度等的影響。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

材料：蠶絲，工業級，杭州林然生物科技公司；DMPG，分析純，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；F12培養基、DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、二甲基亞砜(DMSO)、雙抗、IV型膠原酶、CCK-8試劑盒、細胞篩，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磷酸緩沖溶液(PBS)、溴化鋰(LiBr)、碳酸氫鈉、75%乙醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山羊血清、馬血清、4%多聚甲醛、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)，杭州昊鑫生物科技股份有限公司；透析袋MD34，上海索橋生物科技有限公司；HE染色試劑盒，杭州浩克生物科技有限公司；中性樹膠，國藥集團化學劑有限公司。

儀器：TI-S熒光倒置顯微鏡，日本尼康公司；synergyH1多功能酶標儀、SU8010掃描電子顯微鏡，日本松下集團；RM2255全自動輪轉切片機，德國菜卡公司；BJYSL-DHG-9023A恒溫烘箱，蘇州華潔烘箱制造有限公司；HF90二氧化碳培養箱，力新儀器(上海)有限公司；Sorvall LYNX 6000離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 樣品制備及性能表征

蠶絲的結晶度較高，普通的手段無法使其降解，且因其中含有的絲膠蛋白會引起免疫反應，因此，不能直接用于制備組織工程支架，需先溶解蠶絲纖維得到絲素水溶液[17-18]。

1.2.1 蠶絲脫膠

參照文獻[19]的方法將蠶絲剪成2 cm長度，按照1∶200的浴比加入至0.5%的碳酸氫鈉溶液中煮沸30 min，期間每隔15 min用玻璃棒翻1次；然后依次用去離子水洗脫3次，清洗6次，最后將脫膠的蠶絲放入烘箱，溫度設置為37 ℃，干燥12 h后得到絲素蛋白。

1.2.2 脫膠前后蠶絲形貌觀察

將脫膠前后的蠶絲分別用導電膠貼在工作臺，噴金處理 60 s。采用背散射模式、標準束流，通過掃描電子顯微鏡觀察樣品形貌，加速電壓為 10 kV。然后將樣品的掃描電鏡照片導入 Nano Measurer 1.2軟件中，進行直徑測量。

1.2.3 絲素蛋白的溶解

首先，用600 mL超純水溶解807.7 g無水溴化鋰(LiBr),然后用磁力攪拌器攪拌24 h，完全冷卻后加入超純水至1 000 mL，最后使用真空抽濾機抽濾至澄清，得到濃度為 9.3 mol/L的LiBr溶液。將制得的 LiBr 溶液放入60 ℃的烘箱中預熱 30 min，然后將絲素蛋白按照1∶4的溶質比溶解在9.3 mol/L LiBr溶液中，放入 60 ℃烘箱中溶解2 h，期間每隔15 min 取出攪拌1次，制得絲素蛋白LiBr溶液。將制得的絲素LiBr溶液在透析袋(分子量3 200)中透析3 d，除去絲素LiBr溶液中的LiBr，然后用紗布過濾后，在低溫高速離心機上以7 000 r/min離心 20 min，保留上清液，用0.22 μm針頭濾器過濾上清液后，放入4 ℃冰箱備用。

1.2.4 絲素蛋白水凝膠的制備

首先，分別用去離子水配制5、10、15 mmol/L的DMPG溶液；然后，將絲素蛋白溶液、DMPG溶液振蕩混合均勻，其中絲素蛋白溶液質量分數為4%；最后將共混溶液在25 ℃下培養形成水凝膠。

1.2.5 凝膠時間的測定

使用離心管傾斜法測定凝膠時間。將溶液按照不同的配比裝入1.5 mL的離心管中混合均勻。將離心管在25 ℃下培養，每隔30 s 傾斜1次，每次傾斜大概45°，若10 s內管內液體沒有沿管壁流動則凝膠成功，計算開始至凝膠成功的時間，取3次實驗的平均值記為凝膠時間。

1.2.6 種子細胞的獲取與培養

采用膠原酶消化法分離湖羊骨骼肌衛星細胞，具體操作步驟為：1)在無菌條件下剝離湖羊胎兒后肢腿部肌肉組織，然后用75%乙醇輕微浸泡消毒后立即用PBS沖洗2次，放入盛有PBS的35 mm 細胞培養皿中；2)利用眼科剪將肌肉組織剪碎，加入適量Ⅳ型膠原酶后放入37 ℃、5% CO2培養箱中消化15 min，每隔5 min取出吹打1次，共3次；3)消化結束后，加入2倍體積的DMEM/F12A培養基(DMEM/F12培養基+10%FBS) 終止消化，用細胞篩過濾并收集細胞懸液至15 mL 離心管中，用低速離心機(1 200 r/min)離心15 min，棄上清液；4)加入DMEM/F12B培養基(DMEM/F12培養基+10%FBS+ 1%雙抗)重懸細胞，將細胞懸液接種至100 mm細胞培養皿中，放入37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養，得到的細胞為絲素水凝膠支架種子細胞，后續用于與支架一同注射入湖羊體內。待細胞匯合度達到70%～80%時，可將其作為種子細胞植入到水凝膠中。

1.2.7 SF水凝膠支架生物相容性的測定

將種子細胞培養至對數期，參考文獻[18]方法測定DMPG濃度對SF水凝膠生物相容性的影響如見表1所示。具體步驟為：1)在無菌超凈臺上用75%乙醇浸洗SF水凝膠支架6 min，其次用PBS 反復浸洗5次，每次3 min，浸洗完成后加入F12培養基(不含胎牛血清)浸過水凝膠，在培養箱 (37 ℃、5%CO2) 中靜置24 h 后即可制得SF水凝膠浸提液；2)把生長至對數期的種子細胞接種在96 孔板中，在培養箱中(37 ℃、5%CO2)預培養24 h ，更換細胞培養液，然后加入10 μL預先制備好的SF支架浸提液，不加浸提液的為空白組；3)將96孔板在細胞培養箱中培養12～48 h，取出種子細胞96孔板，向其中的每個孔中加入110 μL CCK-8 工作液，將96孔板在細胞培養箱中孵育30 min 后取出，最后使用酶標儀在450 nm 波長條件下測定各孔吸光度平均值，并通過對照組評定水凝膠的生物相容性(R)。

表1 細胞活力與生物相容性關系Tab.1 Relationship between cell proliferation rate and biocompatibility

式中：A、B、C分別為實驗組、空白組和對照組的吸光度。

1.2.8 體內肌肉再生實驗

首先，用去離子水配制10 mmol/L的DMPG水溶液，放入4 ℃冰箱備用。將生長至對數生長期的種子細胞制成細胞懸液，放入離心管中備用。將絲素蛋白溶液、DMPG溶液、種子細胞懸液混合均勻，使得絲素蛋白溶液質量分數為4%，DMPG的濃度為10 mmol/L，種子細胞的密度為1×105個/mL，振蕩混合均勻后將共混溶液在25 ℃下培養3 min。

將要注射水凝膠的湖羊分為4組，分別是含種子細胞水凝膠組、不含種子細胞水凝膠組、單純種子細胞組和單純絲素蛋白溶液組；每組6只2月齡湖羊，公母各半，每只湖羊注射0.5 mL，做好標記后歸欄飼養，正常飲食。

1.2.9 樣品的HE染色

將湖羊注射部位的皮膚層連同耳部肌肉層一同剪下，此時的水凝膠層在皮膚層和肌肉層之間，將取得的湖羊耳部樣品固定于4%多聚甲醛24 h以上。然后按照HE染色試劑盒的步驟進行染色，將染色結果置于顯微鏡下觀察，進行圖像采集分析。

1.3 數據處理

本文所有統計結果使用SPSS22.0軟件，并采用方差進行單向分析(單向 ANOVA 測試)。差異結果使用P<0.05(*)、P<0.01(**)表示。

2 結果和討論

2.1 蠶絲脫膠分析

弱堿法(碳酸氫鈉)[20]處理的蠶絲，原理是利用絲膠蛋白和絲素蛋白溶解度的不同，除去蠶絲中的絲膠蛋白。蠶絲脫膠前后掃描電鏡照片如圖1所示。可以看出：未脫膠蠶絲(見圖1(a))本身整體呈圓柱形，表面光滑，直徑為7.67～11.4 μm；脫膠處理(見圖1(b))后，蠶絲的直徑為6.36～11.7 μm。脫膠前的蠶絲粗細差別較小，表面規整光滑，脫膠后蠶絲由于失去了絲膠蛋白，蠶絲粗細差別增加，表面粗糙扁平。根據文獻[21]報道，絲膠蛋白的存在會導致免疫原性，通過脫去絲膠蛋白制成的支架沒有免疫原性，因此，除去絲膠蛋白是實驗進行的重要前提。

圖1 脫膠前后蠶絲的SEM照片(×1 000)Fig.1 SEM images of silk before(a)and after(b)degumming(×1 000)

2.2 水凝膠支架凝結時間分析

DMPG濃度對SF水凝膠凝結時間的影響結果如圖2所示。可以看出，隨著DMPG濃度的增加，SF的凝膠時間逐漸變短，凝膠速率逐漸加快。在3個濃度的實驗中，DMPG濃度為15 mmoL/L時可使凝膠時間縮短至10 min，這是因為隨著DMPG濃度的提高，DMPG中的磷脂和SF鏈之間發生靜電和疏水作用，導致SF鏈由無序的α螺旋向β折疊結構轉變，且該轉變是一個不可逆過程，因此，SF凝膠快速形成。綜上分析可知，可通過改變DMPG濃度來控制凝膠時間。

圖2 DMPG濃度對SF水凝膠凝膠時間的影響Fig.2 Effect of DMPG concentration on SF gel of gel time

2.3 水凝膠體外生物相容性分析

圖3示出不同DMPG濃度的水凝膠支架浸出液對種子細胞活力的影響。可以看出：DMPG濃度為10 mmol/L時，制備的水凝膠生物相容性最好；當DMPG濃度為15 mmol/L時雖然凝膠速度最快，但其生物相容性最差。所有加入浸提液的實驗組與空白組相比，細胞活力沒有降低，說明該水凝膠支架沒有細胞毒性，DMPG處理過的實驗組具有優異的生物相容性和生物安全性，同時對細胞增殖有促進作用。

圖3 不同濃度DMPG水凝膠支架的細胞活力Fig.3 Cytotoxicity of hydrogel scaffolds with DMPG different molar concentrations

2.4 水凝膠體內生物相容性分析

圖4示出不同天數樣品水凝膠層的HE染色結果。可以看出：在水凝膠植入24 h后，在SF水凝膠的保護下，其中的種子細胞(見圖4(a) 中黑色圓圈部分)開始增殖分化，通過水凝膠介質與湖羊進行營養物質交換、氣體交換和新陳代謝廢物的排出；隨著植入天數的增加，水凝膠中的種子細胞(見圖4(b) 中黑色圓圈部分)退出增殖周期，水凝膠中的細胞分化為肌肉組織，直到水凝膠中的細胞(見圖4(c) 中黑色圓圈部分)完全分化為肌肉組織。圖4(c) 與圖4(b)相比，水凝膠中的肌原纖維進一步生長，具體表現為長度的延伸，這是因為水凝膠可召集體內的成肌細胞繼續增殖分化，直至水凝膠中的肌肉組織(見圖4(c)中黑色圓圈部分)與正常的肌肉組織HE染色(見圖4(c)中白色圓圈部分)差異逐漸消失。從以上結果可以得出：DMPG誘導的SF水凝膠成功地模擬了天然細胞外基質，且沒有引起湖羊的免疫排斥。結合圖5展示的結果進一步分析表明，水凝膠成功在湖羊皮膚層和肌肉層的空隙中凝結，形成了一層水凝膠，單一加入絲素蛋白或者細胞懸浮液均不會對湖羊產生任何影響。綜上得出，DMPG誘導的SF水凝膠必須加入種子細胞才可以進行組織再生和修復，否則支架會在體內進行降解，而不會有新的組織生成。

圖4 不同天數樣品水凝膠層HE染色結果(×200)Fig.4 HE staining results of hydrogel layers for samples of different days(×200)

圖5 不同天數水凝膠層的寬度Fig.5 Width of hydrogel layers in different days

2.5 水凝膠支架降解分析

圖6示出植入湖羊耳部水凝膠降解的HE染色圖片。由圖6(a)可看出，水凝膠包裹的肌肉細胞進行增殖分化，水凝膠表面逐漸開始降解，形成大小不一的孔隙，肌肉細胞通過這些孔隙可和湖羊進行物質交換(見圖6(b))，保證充足的供給，當肌肉生長到一定程度后，已經能夠自發地從湖羊耳部獲取營養物質(見圖6(c))，便不再需要SF水凝膠支架的存在。由于種子細胞來自湖羊，而且SF水凝膠支架本身不會引起免疫反應，因此，才可以成功地長出新生肌肉。通過上面的結果不難看出：DMPG誘導的SF水凝膠支架是一種綠色可降解的組織工程支架。

圖6 不同天數水凝膠支架HE染色結果Fig.6 HE staining results of hydrogel scaffolds in different days

3 結 論

本文制備了一種可控的、無免疫原性的絲素(SF)蛋白水凝膠，通過改變SF溶液中二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)的濃度，探討并分析其對水凝膠凝膠時間、生物相容性和免疫原性的影響，得出如下主要結論：1)弱堿法可以去除絲膠蛋白，脫膠前后蠶絲直徑變化約為 0.3 μm；2)DMPG加速了SF水凝膠的快速形成，只需要10 min就可使SF成功凝膠；3)水凝膠注射后最終在湖羊耳部皮下和軟骨之間形成0.5 cm的水凝膠-肌肉復合體；4)DMPG誘導的SF水凝膠具有優異的生物相容性，是一種綠色可降解，無免疫原性的組織工程支架。

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