注干施藥后黃山松體內甲維鹽含量檢測及殘留動態分析

孫薇，張立華，王勇軍，陳安良

（1.浙江省臨海市林業技術推廣和場圃旅游服務總站，浙江 臨海 317000；2.浙江省泰順縣自然資源和規劃局，浙江 泰順 325500；3.浙江農林大學 生物農藥高效制備技術國家地方聯合工程實驗室，浙江 杭州 311300）

松材線蟲病是由松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus引起的松屬植物Pinussp.的一種毀滅性病害，導致大量松樹枯死，在我國已經造成了嚴重的經濟和生態損失，是目前最為嚴重的森林病蟲害之一[1]。松材線蟲自然傳播依靠松墨天牛Monochamus alternatus攜帶傳播，其生活史主要在松樹和松墨天牛體內完成，松墨天牛的幼蟲主要在松樹體內活動[2]。傳統的噴粉、噴霧等藥劑防治方法，無法使藥劑直接接觸到靶標生物，導致防治效果低下、藥劑漂移等問題[3]。注干施藥技術是將藥劑有效成分注入樹體，依靠樹木蒸騰作用使藥劑在樹體內擴散分布而發揮藥效，具有施藥精準、防治效率高、環境污染小等優點[4-5]。目前，注干施藥技術已在我國重要生態區和古樹名木的松材線蟲病防治中得到了較好的應用，是一種重要的主動預防措施[3]。

甲維鹽，全稱甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽，是以阿維菌素B1 為原基團合成的生物源殺蟲劑。與阿維菌素相比，甲維鹽因其較高的水溶性而表現出更為高效的殺蟲活性和傳導性能[6]。Takai 等發現甲維鹽對松材線蟲具有顯著的殺線蟲活性，并開發出針對松材線蟲病的甲維鹽水溶性注干劑，取得了顯著的防治效果[7-9]。本課題組前期采用2.3%甲維鹽微乳劑進行注干施藥防治松材線蟲病，效果顯著[10-12]。

甲維鹽在松樹體內的含量和殘留，是其發揮功能的重要前提。當前，甲維鹽在松樹體內的分布規律，尚未有系統研究。本研究測定了甲維鹽注干施藥后在黃山松Pinus taiwanensis體內的殘留動態，分析了注干施藥后藥劑的分布規律，旨在為注干施藥防治技術的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥劑

Waters 600 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；IKA RV10 基本型立式旋轉蒸發儀（廣州儀科實驗室技術有限公司）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；搖擺式萬能高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；RD1000 樹木主干測量儀（美國激光技術公司）。

95.6 %甲維鹽（emamectin benzoate）標準品（佳木斯興宇生物技術有限公司）；注干施藥用甲維鹽藥劑選用2.3%（W/V）甲維鹽微乳劑（浙江錢江生化股份有限公司）。甲醇、乙腈等試劑為色譜純，其他試劑均為分析純，均購自中國國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 松樹二元材積測算方法

采用華偉平等建立的黃山松立木二元材積模型[13]，以距地面1.3 m 處的胸徑（cm）及株高（m）為參數，計算黃山松材積量（m3）。樹木胸圍采用測樹鋼圍尺量測，樹木株高采用樹木主干測量儀或皮尺量測。

1.3 林間注干施藥試驗

1.3.1 試驗地點 研究地點設置在浙江括蒼山國家森林公園（以下簡稱括蒼山）黃山松林（地理坐標為120°56'14''E，28°48'41" N；海拔為900 m），該地自2017 年發生松材線蟲病，為疫區。2019 年，該地松材線蟲病發生面積100 余hm2，枯死松樹1 000 余株。試驗區黃山松生長均一，平均胸徑為16.7 cm，密度約為335 株·hm-2，平均株高為7.6 m，平均材積為0.16 m3。

1.3.2 注干施藥試驗 在括蒼山黃山松林區分別選取2 塊林地作為注干施藥試驗樣地和不施藥空白對照區，面積均為0.72 hm2。在注干施藥區，按照每株50 mL 進行注干施藥。按照黃山松材積測算，有效成分甲維鹽的平均施藥量為7.19 g·m-3。在距地面30 cm 高處松樹主干基部斜向下45°方向，使用電動打孔機打直徑4～ 7 mm、深5～ 8 cm 的小孔，將藥品開口注入孔內。于2020 年1 月31 日進行注干施藥，共注干施藥251 株，空白對照區共240 株。

1.3.3 防治效果計算 分別于2020 年10 月和2021 年10 月調查試驗林地和對照林地當年松樹死亡數量（死亡松樹每年定期全部清理），計算注干施藥處理的預防效果。伐倒試驗樣地中的死亡松樹，鋸取松樹靠上部的莖干，粉碎后采用貝爾曼漏斗法收集松樹體內的線蟲，根據松材線蟲雌蟲尾部鈍圓的典型結構判斷是否為松材線蟲，從而判斷試驗區松樹死亡原因。預防效果計算公式為：

式中，Dc為對照林地的松樹死亡率，Da為注干施藥防治林區的松樹死亡率。

1.4 甲維鹽在松樹體內的含量測定

1.4.1 松樹樣品采集 結合伐區作業，收集試驗樣本材料。將注干后健康松樹伐倒后，松樹主干每隔1 m 用電鋸鋸取0.2 m 厚的松木圓盤備用。松樹側枝沿主干自下往上編號取樣，記錄側枝外圍直徑（cm），每個側枝每隔0.5 m 用電鋸鋸取0.2 m 厚的松木圓盤備用。松樹松針按照側枝編號進行取樣并編號。主干頂梢的松針作為主干松針。在試驗區，注干施藥處理組隨機取黃山松3 株，空白對照處理取1 株。

1.4.2 樣品提取處理 將待測的松樹主干、側枝及松針進行自然晾干，晾干后粉碎至100 目。準確稱取10.0 g樣品置于三角瓶中，加入50 mL 95%甲醇（V/V）作為提取液，超聲振蕩提取1 h，抽濾，用30 mL 甲醇淋洗殘渣，重復3 次。合并濾液及甲醇淋洗相，減壓濃縮至干，用甲醇溶解并定容至2 mL，得提取液，待凈化。

1.4.3 樣品純化 采用ODS 凈化小柱進行純化。選用5 mL 無菌注射器（不帶針頭），在底部放置脫脂棉，真空抽氣，依次加入1 mL 無水硫酸鎂和3 mL ODS 填料。先用5 mL 甲醇/水（95∶5，V/V）活化平衡凈化小柱，再將提取液轉入柱中上樣，加入甲醇至5 mL，開始淋洗，待液面降至3 mL 時立即開始收集淋洗液至10 mL 容量瓶中，用甲醇/水（95∶5，V/V）分次淋洗，每次約1 mL，收集洗脫液至10 mL，得凈化液。

1.4.4 HPLC 檢測條件 采用Waters XBridge C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；檢測波長為244 nm；流動相為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V [水（含0.1%三乙胺）]=50∶42∶8；流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL；柱溫為25℃。

1.4.5 甲維鹽HPLC 標準曲線 用甲醇配制1 000 mg·L-1的甲維鹽標準品母液，稀釋成0.5、1.0、5.0、10.0 和20.0 mg·L-1的標準溶液。以甲維鹽質量濃度為橫坐標，高效液相色譜測定響應值為縱坐標建立標準曲線。

1.4.6 甲維鹽添加回收試驗 在黃山松側枝和針葉制備樣中，分別添加甲維鹽標準品，添加水平分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 和10.0 mg·kg-1，進行添加回收試驗，計算甲維鹽的回收率。

1.5 統計分析

所有數據采用SPSS v.19 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 林間注干施藥防治效果

注干施用甲維鹽后，試驗區松材線蟲病發生調查結果見表1。由表1 表明，甲維鹽注干施藥對黃山松林的松材線蟲病防治效果顯著。2020 年10 月，注干處理區黃山松無松樹死亡，預防效果達到100%。2021 年10 月，黃山松林試驗區，注干施藥處理預防效果保持100%。空白對照區發病嚴重，每年4 月前清理死樹，2020 年和2021 年，松樹死亡率分別達到5.42%和9.25%。所有死亡松樹體內，都分離獲得了松材線蟲，判斷為松材線蟲病致死松樹。

表1 甲維鹽注干施藥對黃山松松材線蟲病的預防效果Table 1 Effect of trunk injection of emamectin benzoate onpine wilt disease on P.taiwanensis

2.2 甲維鹽標準曲線及添加回收率

甲維鹽標準樣品檢測標準曲線見圖1。在0.1～ 20.0 mg·L-1濃度范圍內，甲維鹽質量濃度與HPLC 峰面積呈良好的線性關系，得出回歸方程為y=12 546x– 1 051，相關系數R2為0.999。采用凈化小柱進行純化后，添加回收試驗結果見表2。由表2 表明，在0.1～ 10.0 mg·kg-16 個添加水平下，甲維鹽在黃山松枝干的回收率在81.18%～ 86.41%，相對標準偏差在1.33%～ 5.83%。甲維鹽在針葉中的回收率較高，為92.81%～ 94.07 %，相對標準偏差為1.39%～ 3.48%。根據添加回收試驗結果，甲維鹽的最低添加水平確定定量限（LOQ）設為0.1 mg·kg-1。

表2 黃山松枝干和針葉中甲維鹽添加回收率Table 2 Recovery of emamectin benzoate in truck,branch and needle of P.taiwanensis

圖1 甲維鹽檢測標準曲線Figure 1 Standard curve of emamectin benzoate by HPLC

2.3 注干施藥后甲維鹽在黃山松體內的分布動態

采用HPLC 方法，測定了注藥后不同時間甲維鹽在樹體內的殘留量（表3），在注干施藥當年，甲維鹽在松樹體內維持著較高的殘留濃度，其中在主干上的殘留濃度較高，表現出在注射點附近濃度較高，隨著距注射點距離的增加總體呈下降趨勢。甲維鹽最高殘留濃度出現在距注入孔2 m處，殘留濃度為29.95 mg·kg-1，最低殘留濃度出現在距注入孔5 m 處，殘留濃度為8.43 mg·kg-1，主干針葉中的殘留濃度為8.46 mg·kg-1。甲維鹽在側枝上的分布從分支處到頂部表現出下降的趨勢，第1 側枝中殘留濃度從15.07 mg·kg-1下降到5.92 mg·kg-1，第1 側枝針葉中殘留濃度為3.53 mg·kg-1；第2 側枝中殘留濃度從11.20 mg·kg-1下降到3.02 mg·kg-1，第2 側枝針葉中殘留濃度為3.12 mg·kg-1。空白對照松樹主干、枝和針葉組織內均未檢測到甲維鹽。

表3 注干施藥后甲維鹽在黃山松的殘留濃度Table 3 Residue of emamectin benzoate in P.taiwanensis after trunk injection

2021 年10 月，即注干施藥翌年，松樹體內仍有甲維鹽殘留，和2020 年相比，殘留濃度均有降低。甲維鹽濃度隨著分布點到注射點距離的增加逐漸下降，主干中的平均殘留濃度為2.95～ 5.38 mg·kg-1，主干針葉中的平均殘留濃度為1.12 mg·kg-1；第1 側枝中的平均殘留濃度為1.36～ 2.41 mg·kg-1，第1 側枝針葉中的平均殘留濃度為0.53 mg·kg-1；第2 側枝中的平均殘留濃度為1.02～ 2.20 mg·kg-1，第2 側枝針葉中的平均殘留濃度為0.46 mg·kg-1。

3 結論與討論

甲維鹽注干施藥技術在國內外防治松材線蟲病中得到了成功的應用[3,9-10]，但甲維鹽注干施藥后的殘留分布動態尚未有系統研究。黃山松為松材線蟲易感樹種[14]。本研究以浙江括蒼山的黃山松為研究對象，跟蹤測定了甲維鹽注干施藥后對松材線蟲病的防治效果及在松樹體內的殘留動態分布。甲維鹽注干施藥后黃山松在2 年內免受松材線蟲的侵染，具有顯著的防治效果，與在馬尾松P.massoniana上的試驗效果一致[10]。甲維鹽注干后，可在主干、側枝以及松針組織內檢測得到較高濃度的甲維鹽殘留，并在2 a 內維持殘留藥效。研究結果為甲維鹽注干施藥防治松材線蟲病提供了理論基礎。

甲維鹽殘留含量測定主要包括樣品前處理和含量測定兩個環節[15]。甲維鹽含量測定，通常采用液相色譜-熒光法[16]、柱前衍生-高效液相色譜法[17]以及反相HPLC-910UVD 法[18]等，檢測靈敏度均較高。樣品的前處理方式往往是影響農藥殘留含量測定的主要因素[19]。目前，針對松木等硬質植物樣品的提取及純化的方法較少。李長強等測定了松木烘干粉碎后，阿維菌素添加回收率為65%～ 75%，最低檢測質量濃度為0.1 mg·kg-1[20]。本研究采用松木烘干粉碎后，用無水硫酸鎂和ODS 填料進行凈化處理，甲維鹽在松木枝干中的回收率在81%～ 86%，相對標準偏差較小，在針葉中的回收率在92%～ 94 %，最低添加水平的定量限（LOQ）為0.1 mg·kg-1。本研究采用的前處理方法顯著提高了甲維鹽的回收率，可用于甲維鹽在硬質植物材料中的殘留測定。

注干施藥后甲維鹽殘留含量動態是分析藥劑發揮藥效及時效的重要依據[7]。本研究在浙江括蒼山黃山松林開展了注干施藥后甲維鹽殘留動態的分析，結果發現，在注干施藥當年，甲維鹽在松樹體內維持著較高殘留濃度，其中在主干上的殘留濃度高于在側枝內的殘留濃度，針葉內含有一定濃度的甲維鹽。注干施藥后第二年，甲維鹽在主干、枝干以及針葉中依然維持高于松材線蟲致死中濃度[10]，進一步解釋了在注干施藥第二年，試驗區松林的松材線蟲預防效果保持100%。本研究結果為松材線蟲病主動預防和松材線蟲病綜合防控提供了依據，也將為藥劑在森林環境中的衰退規律及對生態的影響提供基礎。下一步，將針對藥劑種類、松樹品種以及地理氣候條件等因素對藥劑的殘留分布動態及防控效果的影響開展研究。