補腎活血方對復發性流產小鼠母胎界面血管微環境的影響

夏壘，韓雪，董莉，夏艷秋

1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.西安市中醫醫院，陜西 西安 710016；3.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是常見的妊娠并發癥，發生率為1%～5%，目前仍有超過半數的RSA病因尚不明確。無論何種病因，母胎界面局部微環境在妊娠建立和維持中都起到重要作用。母胎界面中胎盤微血管的生成及胎盤血管網絡的構建對妊娠維持至關重要。有學者認為，RSA的發生與妊娠期母體子宮螺旋動脈和胚胎絨毛血管中形成微小血栓有關，其可能導致子宮-胎盤循環血液灌注不良，增加妊娠丟失的風險。

補腎活血方是國醫大師朱南孫教授臨床治療RSA的經驗方，前期研究顯示，該方有助于改善患者卵巢血流動力情況，調節炎癥因子平衡。本研究在前期研究基礎上觀察該方對RSA小鼠母胎界面血管生成及微小血栓的影響，進一步探討其作用機制，以期為臨床應用和后續研究提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性CBA/J小鼠40只、雄性DBA/2J小鼠15 只、雄性BALB/c 小鼠5 只，6～7 周齡，體質量（20±2）g，上海吉輝實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0012。常規飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心SPF級動物房，溫度25～27 ℃，濕度40%～50%，12 h光照/黑暗循環，自由攝食飲水。

1.2 藥物

補腎活血方（黃芪20 g，黨參20 g，丹參20 g，當歸20 g，巴戟天15 g，淫羊藿15 g，菟絲子12 g，熟地黃12 g，覆盆子12 g），由上海中醫藥大學中藥制劑中心制成湯劑，每1 mL含原藥材1.46 g，置于4 ℃冰箱冷藏備用。地屈孕酮片，荷蘭Abbott Biologicals B.V.，10 mg/片，批號360591，藥片碾碎后用蒸餾水溶解，制成濃度為1 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒、Trizol、一氧化氮（NO）檢測試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為C0105M、R0016、S0021S、P0013、P0009；RT-PCR 試劑盒，日本TaKaRa公司，批號RR047A；血管內皮生長因子（VEGF）抗體、血管內皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）抗體、GAPDH 抗體、HRP 標記羊抗鼠IgG、HRP 標記羊抗兔IgG，美國Proteintech 公司，批號分別為 19003-1-AP、66804-1-lg、60004-1-lg、SA00001-1、SA00001-2；ECL發光液，美國Millipore公司，批號WBKLS0100；血栓素B2（TXB2）試劑盒、6-酮前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號分別為H173、H204-1。HM325石蠟切片機（美國Thermo 公司），EG1150 自動包埋機（德國Leica 公司），Axio Scope.A1 光學顯微鏡（德國Carl Zeiss公司），SCIENTZ-48高通量組織研磨器（中國寧波新芝生物科技股份有限公司），Centrifuge 5427R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），QuantStudio3實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），VORTEX-6渦旋振蕩儀（上海其林貝爾），Synergy2多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司），PowerPAC3000垂直電泳儀（美國Bio-Rad 公司），FluorChem R 化學發光成像系統（美國Protein Simple公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

小鼠適應性喂養1周后，將CBA/J雌鼠與DBA/2J雄鼠2∶1合籠飼養建立RSA模型，同時將CBA/J雌鼠與BALB/c雄鼠2∶1合籠飼養建立正常妊娠作為正常組，次日檢查雌鼠陰道，見陰栓者表明造模成功，若未見陰栓，則繼續合籠飼養。將成模小鼠隨機分為模型組、中藥組和西藥組，每組10只。鏡下見精子或陰道口見陰栓當天記為妊娠第1日，各組于妊娠第1日開始灌胃，根據小鼠與成人體表面積換算等效劑量，中藥組灌胃補腎活血方（30 g/kg），西藥組灌胃地屈孕酮溶液（6.15 mg/kg），灌胃體積0.3 mL/只，正常組和模型組予等體積蒸餾水灌胃，連續13 d。

2.2 標本采集

小鼠末次灌胃24 h 后腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，摘眼球取血，剖視子宮觀察胚胎情況并拍照；分離蛻膜組織，液氮速凍后置-80 ℃冰箱中保存。

2.3 胚胎丟失率計算

統計胚胎總數、流產胚胎數，計算胚胎丟失率。胚胎丟失率（%）＝流產胚胎數÷總胚胎數×100%。

2.4 HE染色

將蛻膜組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水，透明，包埋，切片（厚度6 μm），脫蠟，脫水，蘇木精染色8 min，流水沖洗，伊紅染色1 min，流水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片后，置于光鏡下觀察蛻膜組織病理形態。

2.5 RT-PCR檢測

取蛻膜組織，加入Trizol提取總RNA，微量分光光度計測定RNA 純度及濃度。將總RNA 反轉錄為cDNA，擴增程序為兩步法：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。以18S為內參，2法計算mRNA 相對表達量。透明質酸合成酶（HAS）引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 Western blot檢測

取蛻膜組織，加入RIPA裂解液，勻漿研磨機研磨，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。等量蛋白上樣，10%凝膠電泳，將蛋白電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加VEGF一抗（1∶1 000）、VE-cadherin一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發光液曝光，化學發光成像系統成像，以GAPDH為內參，采用AlphaView SA軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

2.7 硝酸還原酶法檢測

取蛻膜組織，加入裂解液，勻漿研磨機研磨，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，按50μL/孔向96 孔板中加入標準品或樣品，再分別加入Griess ReagentⅠ和Griess ReagentⅡ，酶標儀波長540 nm處檢測各孔OD值，根據標準曲線計算樣品中NO含量。

2.8 ELISA檢測

將血液于室溫靜置10 min，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀波長450 nm處檢測各孔OD值，根據標準曲線計算血清TXB2和6-Keto-PGF1α含量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 補腎活血方對模型小鼠胚胎丟失率的影響

正常組小鼠胚胎粗大如串珠狀，胚胎發育均勻，顏色淡紅，宮腔內無出血點及明顯瘀血；模型組小鼠胚胎呈竹節樣改變，胚胎發育不勻稱或體積縮小甚至無胚胎，顏色黯紅或黑褐，宮腔內可見明顯出血點或瘀血；中藥組和西藥組小鼠胚胎形態明顯改善，胚胎發育較均勻。見圖1。

圖1 各組小鼠胚胎形態

與正常組比較，模型組小鼠胚胎丟失率顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠胚胎丟失率顯著降低（＜0.01，＜0.05）；中藥組與西藥組差異無統計學意義（＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠胚胎丟失率比較（）

4.2 補腎活血方對模型小鼠蛻膜組織病理形態的影響

正常組小鼠蛻膜細胞呈卵圓形，排列整齊，胞質豐富，核仁明顯，血管豐富，管壁完整；模型組小鼠蛻膜細胞碎裂，數量減少，胞漿水腫、空泡樣變，部分細胞核消失，血管數量減少；中藥組小鼠少數蛻膜細胞胞漿水腫、空泡樣變，血管內皮細胞較為完整，生長良好；西藥組小鼠部分蛻膜細胞胞漿水腫、空泡樣變，血管內皮細胞不完整。見圖2。

圖2 各組小鼠蛻膜組織形態（HE染色，×200）

正常組小鼠迷路滋養層細胞呈網狀排列，細胞核清晰，胞質豐富，母血竇豐富，組織結構清晰；模型組小鼠迷路滋養層細胞增生肥大，細胞核和胞質界限模糊，胞漿廣泛空泡化，部分細胞變性、壞死、結構不清晰；中藥組小鼠迷路滋養層細胞呈網狀排列，細胞核清晰，胞質豐富，母血竇較為豐富，整體結構完整；西藥組小鼠迷路滋養層細胞呈網狀排列，部分細胞核染色加深，形態不規則，胞漿呈空泡樣改變，部分區域結構不清晰。見圖3。

圖3 各組小鼠迷路組織形態（HE染色，×200）

4.3 補腎活血方對模型小鼠蛻膜組織透明質酸合成酶mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA 表達均顯著降低（＜0.05，＜0.001，＜0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠蛻膜組織HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA表達均顯著升高（＜0.05，＜0.01，＜0.001）。見表3。

表3 各組小鼠蛻膜組織HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA表達比較（）

4.4 補腎活血方對模型小鼠蛻膜組織血管內皮生長因子、血管內皮鈣黏蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織VEGF、VE-cadherin表達顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠蛻膜組織VEGF、VE-cadherin表達顯著升高（＜0.01，＜0.001），且西藥組顯著高于中藥組（＜0.05，＜0.01）。見圖4。

圖4 各組小鼠蛻膜組織VEGF、VE-cadherin蛋白表達比較（，每組10只）

4.5 補腎活血方對模型小鼠蛻膜組織一氧化氮含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織NO含量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠蛻膜組織NO含量顯著增加（＜0.01，＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠蛻膜組織NO含量比較（，mol/L）

4.6 補腎活血方對模型小鼠血清血栓素B2、6-酮前列腺素F1α含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清6-Keto-PGF1α含量顯著減少（＜0.001）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠血清6-Keto-PGF1α 含量顯著增加（＜0.001）。各組小鼠血清TXB2含量差異無統計學意義（＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量比較（，ng/L）

5 討論

RSA屬中醫學“滑胎”范疇，該病具有連續性、自然性和應期而下的特點。朱氏婦科認為，本病病機多為腎虛與血瘀共存，腎虛為本，血瘀為標，治以補腎固胎、活血化瘀為主。據此，朱氏婦科第三代傳承人國醫大師朱南孫教授秉朱氏婦科“究奇經，養氣血，毓麟之本”學術思想，創立補腎活血方，方中以巴戟天、淫羊藿為君藥補腎填精；黃芪、黨參、當歸、丹參為臣藥補氣活血；熟地黃為佐藥滋養腎精；菟絲子、覆盆子為使藥平補肝腎。諸藥共奏補腎活血、祛瘀安胎之功。

正常妊娠的維持有賴于母胎界面及胎盤植入部位的豐富血供，胎盤血管網絡充分發育使母胎間營養物質等交換順利進行，胚胎得以生長發育。透明質酸（HA）是一種位于血管內皮細胞外的大分子多糖，可直接影響血管生成，通常表達于絨毛細胞外基質和血管壁，能夠維持胎盤形態及子宮胎盤血液循環。正常早孕階段胎盤組織HA含量明顯高于RSA組，高濃度和完整狀態的HA在維持正常妊娠中具有重要作用。HAS是一類高效的雙功能糖基轉移酶，催化尿苷-5'-二磷酸-葡糖醛酸和尿苷-5'-二磷酸-乙酰氨基葡萄糖聚合為HA長鏈，可控制細胞遷移，修復磷狀上皮細胞，在排卵期、胚胎形成及機體發育過程中均有所表達，可在一定程度上起到補償組織細胞、維持器官功能的作用。HA的正常聚合可以增加胎盤中VEGF表達，從而在胚胎發育過程中調控母胎界面血管生成。研究發現，小鼠VEGF基因缺失會導致胚胎血管發育缺陷而致胚胎死亡，VEGF過表達會使母胎界面血管腔異常增大，導致胚胎數量減少和胚胎丟失率增加。NO作為VEGF的效應因子和誘導因子，在構建母胎界面血管生成渠道中擔任重要角色，適量NO的產生是胎盤血管調節機制完善的體現。NO含量減少與HA降解直接相關，NO缺乏導致妊娠小鼠子宮動脈直徑縮小，子宮血流量減少。VE-cadherin是鈣黏素家族的重要成員，主要功能是維持血管內皮細胞相互連接、血管完整性和血管新生，缺乏VE-cadherin會影響VEGF介導的內皮細胞存活和血管生成，導致胚胎死亡。本實驗中VE-cadherin蛋白在模型組小鼠蛻膜組織中低表達，中藥組和西藥組表達升高，且西藥組異常高表達，這可能與西藥組高表達VEGF有關。研究表明，VEGF可以上調VE-cadherin表達及磷酸化，但VE-cadherin過表達容易引起細胞間黏附加強，具有抑制滋養層細胞遷移、浸潤作用，滋養層細胞浸潤不足會造成自然流產。因此，西藥組VE-cadherin高表達可能不利于新生血管生成。而補腎活血方對于新生血管內皮細胞間的連接具有保護作用，能維持血管內皮屏障功能。TXB2、6-Keto-PGF1α互為拮抗作用，在管壁緊張度、血小板激活和血流機制中起相反調節作用，6-Keto-PGF1α/TXB2 比例降低會導致血栓風險增加。本實驗中除模型組小鼠血清6-Keto-PGF1α 含量顯著減少外，正常組、中藥組和西藥組小鼠血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量無明星差異，提示中藥和西藥可增加小鼠外周血6-Keto-PGF1α含量以降低血栓風險。

綜上所述，補腎活血方可顯著降低RSA小鼠胚胎丟失率，增加血清6-Keto-PGF1α含量及蛻膜組織NO含量，上調VEGF、VE-cadherin、HAS 表達，改善RSA導致的血管生成障礙及血栓形成，實現母胎界面血管重塑，調節母胎界面血管微環境，減少不良妊娠結局。