肉雞新城疫病毒的診斷及治療

夏 偉，李 華，冷敦鵬，張 浩，王友娟，李勤芳，劉思喜（青島中仁動物藥品有限公司 266329）

雞新城疫是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）引起的一種急性敗血性傳染病，俗稱亞洲雞瘟，主要侵害雞和火雞[1]。雞群感染新城疫病毒后，常出現體溫升高、呼吸困難、下痢、綠便、呼吸道和消化道發生出血性炎癥，可引起較高的死亡率[2]。目前新城疫仍是困擾我國養雞業的重要疫病之一，被世界動物衛生組織（OIE）列為法定報告的動物疫病，我國農業部將其列為一類動物疫病。

新城疫病毒（NDV）屬副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬，禽副黏病毒。新城疫病毒基因組由一條單股RNA組成，含有6種病毒特異性結構蛋白（L、NP、P、HN、M、F）和2種非結構蛋白V和蛋白W[3]。新城疫病毒主要存在于病雞喉氣管、肺臟、脾臟及體液、分泌物和排泄物中，宿主范圍廣泛，給養禽業和公共衛生安全帶來了較大的隱患。

目前對于新城疫病毒檢測方法主要包括：雞胚接種、血凝和血凝抑制試驗、瓊脂擴散、免疫熒光技術等，但RT-PCR檢測方式具有敏感性高、特異性強的優點。

山東省膠州某大型肉雞養殖集團飼養的肉雞在18日齡出現食欲不振，采食量降低，體溫升高至42℃～43℃，呼吸不暢，出現雞冠發紫，排綠色稀糞等癥狀。剖檢癥狀為鼻腔和氣管內有黏液；全身漿膜和黏膜出血；氣管和喉頭充血、出血；肺臟、胰腺出血；腎臟腫大出血；尤其是腺胃乳頭與肌胃、食道交界處出血更加明顯，初步確認感染新城疫病毒。在臨床癥狀基礎上進行RT-PCR實驗，對病毒進行驗證。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒RNA快速抽提試劑盒、一步法RT-PCR擴增試劑盒、DNA分子量標準Marker（100-2000bp）均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 引物設計及合成

以F蛋白基因序列為模板，運用PrimerPremier5.0和DNAMAN進行引物設計篩選，由深圳華大基因科技有限公司進行特異性引物合成。上游引物為GAAGGCGCACTTACTACAC，下游引物為TCCCAAGCCATAATAAGGT，預計擴增片段為496bp。

1.3 病原RNA提取

將采集的10份雞喉氣管組織樣品研磨后，按照1∶5的比例加入生理鹽水混合，反復凍融3次，3000r/min離心10min，取上清后備用。采用病毒RNA快速抽提試劑盒進行病毒RNA的提取。

1.4 RT-PCR反應條件

PCR反應體系25.0μL：

10×OneStepRT-PCRBuffer2.5μL、上、下游引物各1μL、AMVRT0.25μL、TaqDNApolymerase0.25μL、RNaseInhibitor0.25μL、模板1.0μL、RNase-freeddH2O18.75μL。

最佳擴增程序：

45℃反 應30min；95.0℃預 變 性5min；94.0℃1min，58.5℃1min，72.0℃1min，進行35個循環；72.0℃延伸10min。

1.5 電泳

反應結束后，取5μLPCR產物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

2 結果

2.1 剖檢臨床癥狀

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

用新城疫病毒特異性引物進行RT-PCR反應，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，10份樣品均在250～500bp，接近500bp處出現明亮的單一條帶（如圖1）。

圖1 臨床剖檢圖

圖2 RT-PCR擴增結果

2.3 治療措施

結合臨床癥狀及RT-PCR檢測結果，判斷肉雞感染雞新城疫病毒。肉雞在18日齡正處于免疫力最為薄弱的階段，極易出現死亡現象。對癥治療，選用卡巴匹林鈣、金銀花、黃芪多糖等進行飲水治療，起到清熱解表、提高免疫力的作用。常規飲水方面：添加電解多維等，目的在于對脫水的控制、對體內鈉的調節、減少應激；同時鑒于可能發生繼發感染的情況，還應結合使用抗菌藥物，例如，氨芐西林、硫酸黏菌素等。每日兩次，連用3～5d。

2.4 治療效果評價

在用藥1d后觀察死亡率，結果表明：在用藥第2d后，死亡率明顯下降；待第4d后，死亡率得到了控制；在第5d時，未見死亡數。從雞的癥狀上來看，呼吸困難的癥狀都已消失，治療獲得了較好的效果。

3 討論

隨著我國家禽業的規模化集約化發展，雞群混合感染和二次感染現象日益增多。目前新城疫是影響家禽業持續發展的主要疾病之一，引起了人們的高度重視[4]。鑒于新城疫對我國禽業的危害，急需建立一種特異性好、靈敏度高，可以快速、準確地檢測NDV的診斷方法，提高我國禽業關于病毒的檢測水平。

雞新城疫是一種致死率較高的禽類傳染病，所以在養殖過程中還是要以預防為主，及時做好養殖場的清理、消毒工作；做好疾病的檢疫和接種工作。有研究表示黃芪、大青葉、金銀花、板藍根、百花蛇舌草、魚腥草、野菊花等幾類中藥在抑制雞新城疫病的療效上有所區別，其中金銀花具有較顯著的抗病毒效果[5]。在疾病發生早期發現，早利用中西醫結合的方式給予治療，在很大程度上還是可能治愈的，極大地降低雞新城疫引發的經濟損失，這對于提升養殖戶的經濟收益，促進我國禽類產業的發展有巨大作用。