半夏外植體消毒方法比較研究

張兆萍，陳 芳，王玉紅，張梅秀，龔永福，王 笑，臧廣鵬，常 瑜，魏玉杰*，蘇毓杰

(1.甘肅省農業工程技術研究院，甘肅武威 733006；2.甘肅省特種藥源植物種質創新與安全利用重點實驗室，甘肅武威 733006)

半夏[(Thunb.)Breitenb]又名三興草、地星、三葉半夏等，為天南星科半夏屬多年生草本植物，干燥塊莖具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效。除內蒙古、新疆、青海、西藏外，全國其他各地廣布野生半夏，其已有2 000多年的臨床藥用歷史，是30種應用最廣泛的中藥之一。傳統中藥以采挖野生半夏為主，但由于半夏資源超量開發與利用，野生半夏資源已日漸枯竭。為滿足藥用需求，半夏人工栽培的面積不斷擴大，但在生產過程中發現，栽培半夏多采用小塊莖、珠芽等方法進行繁殖，不僅存在種苗短缺、繁殖系數較低的問題，而且多代無性繁殖易造成種質退化、病毒感染嚴重，引起葉片斑駁、變形、皺縮、卷曲等癥狀，使植株生長不良，減產可達60%，嚴重影響產量和藥用品質，同時，由于各地間相互引種，造成種質資源混亂，藥材質量難以保證。采用組織培養技術不僅可以有效地保存半夏種質資源，而且能進行優良品種的快速繁殖，滿足生產上的需要，從而有效保障半夏品質。

半夏組織培養開始于20世紀80年代，經過眾多科學工作者的不斷探索研究，目前已逐漸形成一套完整的組織培養體系，但主要集中于脫毒快繁、遺傳轉化體系建立和生物堿代謝方面，而對外植體的選擇相關研究較少。外植體本身所特有的因子對培養物的器官分化和形態建成有決定性的影響，因此，開展半夏組培過程中外植體種類及有效消毒方式的篩選對半夏胚性愈傷組織誘導十分必要。該研究分別以野生半夏和栽培半夏的珠芽和塊莖2個典型取材部位為外植體，研究不同種類消毒劑組合對珠芽和塊莖污染率、成活率的影響，分析比較野生與栽培半夏組織培養的差異，篩選出半夏適宜組織培養的外植體類型及最佳消毒方式誘導愈傷培養，以期為半夏組織培養快繁體系的建立及分子育種提供技術參考。

1 材料與方法

供試材料野生半夏塊莖、株芽來自隴南市西和縣，栽培半夏塊莖、株芽來自天水市清水縣。MS培養基購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司，其余化學試劑均為國產分析純。

外植體前處理。選擇整齊、大小一致的野生半夏、栽培半夏塊莖、珠芽，流水沖洗干凈表層灰塵、泥土等物質，用手輕輕剝去種球、珠芽表層多余雜質；放入干凈廣口瓶內，用自來水沖洗數遍；加入少許洗潔精，輕搖沖洗30 min；反復用清水沖洗干凈洗潔精，直至無泡沫；用超純水沖洗5～6遍，放入紫外殺菌后的超凈臺，以備下一步工作。

外植體消毒處理及接種。外植體消毒處理見表1。每次消毒劑處理期間均需不停搖晃消毒瓶，保證外植體充分接觸消毒劑，取出后用無菌水清洗5～6遍備用。分別將種球、珠芽放置于干凈濾紙上，每個消毒處理接種60瓶，每瓶接種1個外植體，培養基為不添加激素的MS培養基。培養30 d后統計污染率和成活率。外植體接種后，光照強度2 000 lx，光照時間 12 h/d，培養溫度(25±1)℃。

表1 不同消毒方式及處理時間Table 1 Different disinfection methods and treatment time

采用以下公式計算污染率和成活率。

污染率=(污染材料數/總接種材料數)×100%

(1)

成活率=(成活材料數/總接種材料數)×100%

(2)

試驗數據用Excel整理，用SPSS 17.0軟件進行方差分析及顯著性分析。用隸屬函數評價方法評價12個處理污染率和成活率。隸屬函數值計算公式如下：

式中，表示第個指標值，為第個指標的最小值，為第個指標的最大值，若該指標與產量呈相反關系則為負向指標。

2 結果與分析

塊莖消毒比較。從圖1可以看出，NaClO和HgCl不同消毒濃度和處理時間對野生、栽培半夏塊莖污染率和成活率影響很大。X～X處理為NaClO消毒，同一濃度隨處理時間延長，野生和栽培半夏塊莖均表現為污染率降低，成活率升高，但變化幅度較小，無顯著差異；相同處理時間(X、X、X，X、X、X，X、X、X)，隨著NaClO濃度升高，半夏塊莖污染率降低，說明NaClO消毒濃度比其作用時間對半夏外植體污染率的影響更大。X～X處理為HgCl消毒，隨著0.1% HgCl處理時間延長，野生、栽培半夏塊莖污染率均表現為XX>X，栽培半夏塊莖成活率為X>X>X。

X～X處理半夏塊莖污染率在73.33%～95.56%，成活率在1.67%～22.22%，X～X處理半夏塊莖污染率在10.56%～22.22%，成活率在64.44%～73.89%，可見采用HgCl進行半夏塊莖消毒污染率顯著低于NaClO，成活率顯著高于NaClO。綜合考慮污染率及成活率，可知適合半夏塊莖消毒的最佳處理為X。比較野生半夏塊莖和栽培半夏塊莖污染率和成活率可知，相同消毒處理下，野生半夏塊莖與栽培半夏塊莖污染率多數表現為野生半夏塊莖污染率低于栽培半夏塊莖污染率，野生半夏塊莖成活率高于栽培半夏塊莖成活率。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)Note：Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments of the same variety(P<0.05)圖1 不同消毒處理下野生與栽培半夏塊莖污染率、成活率的比較Fig.1 Comparison of contamination rate and survival rate of wild and cultivated Pinellia ternata tubers under different disinfection treatments

珠芽消毒比較。從圖2可以看出，采用HgCl對半夏株芽進行消毒處理(X～X)時，污染率顯著低于NaClO處理(X～X)，成活率顯著升高。不同NaClO處理時間及濃度對半夏株芽污染率影響較小，而株芽污染率為71.67%～91.11%，成活率均較低，為5.00%～23.33%，而采用HgCl處理時，株芽污染率降至7.22%～13.33%，成活率達66.11%～73.89%，故采用HgCl進行半夏株芽消毒效果較好。比較不同0.1% HgCl處理時間，野生、栽培半夏株芽污染率為XX>X，栽培半夏株芽成活率為X=X>X，綜合考慮污染率及成活率，可以得出適合半夏株芽消毒的最佳處理為X。

由圖2可知，野生半夏株芽與栽培半夏株芽污染率存在差異，多數表現為野生半夏株芽污染率低于栽培半夏株芽污染率，野生半夏株芽成活率高于栽培半夏株芽成活率。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)Note：Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments of the same variety(P<0.05)圖2 不同消毒處理下野生與栽培半夏株芽污染率、成活率的比較Fig.2 Comparison of contamination rate and survival rate of wild and cultivated Pinellia ternata buds under different disinfection treatments

相同消毒處理下野生半夏不同外植體間消毒比較。由表2可知，同一處理野生半夏塊莖與株芽間污染率、成活率存在差異，除X處理外，其余處理均為株芽污染率低于塊莖污染率；除X、X、X外，其余處理株芽成活率均高于塊莖成活率，污染率變化趨勢與成活率呈相反趨勢。

表2 相同消毒處理下野生半夏塊莖與株芽間污染率、成活率的比較Table 2 Comparison of contamination rate and survival rate of tuber and plant bud of wild Pinellia ternata under the same disinfection treatment %

相同消毒處理下栽培半夏不同外植體間消毒比較。由表3可知，同一處理栽培半夏塊莖與株芽間污染率、成活率存在差異，與野生半夏塊莖、株芽變化規律一致，除X處理外，其余處理均為株芽污染率低于塊莖污染率；除X、X外，其余處理株芽成活率均高于塊莖成活率，污染率變化趨勢與成活率呈相反趨勢。

隸屬函數法可以將定性評價轉化為定量評價，還能消除單一指標的片面性，應用非常廣泛。利用隸屬函數法對12個處理污染率和成活率進行多指標綜合評價，值越大，處理的外植體生長越好(表4)。X處理，野生塊莖、栽培塊莖、野生珠芽、栽培珠芽隸屬函數平均值排名分別為3、9、1、4，均優于其他處理，表明X處理是適合半夏外植體消毒的最佳處理。

表3 相同消毒處理下栽培半夏塊莖與株芽間污染率、成活率的比較Table 3 Comparison of contamination rate and survival rate of tuber and bud of cultivated Pinellia ternata under the same disinfection treatment %

3 討論與結論

根據植物細胞的全能性，在植物組織培養過程中任何組織均可作為外植體，但不同部位組織脫分化和再分化難易程度不同，以及滅菌難度差異較大，所以在組織培養時外植體的選擇十分重要。在半夏組織培養過程中，通常選用葉片、葉柄、塊莖、莖尖、根和珠芽作為外植體。

該研究結果表明，相同的消毒處理下，野生半夏塊莖、株芽污染率低于栽培半夏塊莖、株芽污染率，且同種類型半夏品種株芽的污染率較塊莖的污染率低。這可能是因為野生半夏生長環境單一，受外在條件影響小，而栽培半夏受人為施肥、打藥等管理影響，生長環境相對復雜。同理，塊莖染菌率高，較難消毒也可能是因為塊莖生長于地下，環境復雜，相對株芽接觸細菌及霉菌較多，不易清除，這與吳能表等的研究結果一致。

表4 隸屬函數值及綜合排名Table 4 Membership function value and comprehensive ranking

該研究結果還表明，分別以NaClO和HgCl作為消毒劑，野生、栽培半夏塊莖、株芽的污染率、成活率均具有明顯差異。且NaClO消毒濃度比NaClO作用時間對半夏外植體污染率的影響大。隨著0.1% HgCl處理時間延長，外植體的染菌率逐漸減少，但成活率也有一定降低。HgCl和NaClO是植物組織培養中常用的消毒劑，其中HgCl消毒效果極佳，但HgCl為劇毒物質，對植物細胞傷害大。鑒于半夏的生長習性，組織培養時外植體細菌比較頑固，采用HgCl進行消毒效果佳，但如果消毒劑浸泡時間過長，則容易導致植物細胞受損嚴重而影響外植體的存活率，可見消毒時間越長對外植體傷害越大，這與金青等的研究結果一致。該試驗最終篩選出采用X處理(75%乙醇50 s、0.1%HgCl10 min)時，半夏塊莖、株芽消毒效果最好，此時污染率低，而成活率較好。