大豆維生素E 及組分含量特異種質發掘鑒定

上官文秀 ，王 敏 ，岳愛琴 ，趙晉忠 ，牛景萍 ，張永坡 ，高春艷 ，張武霞 ，郭數進 ，王 鵬 ，王利祥 ，楊婷婷 ，張海生 ，杜維俊

（1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 基礎部，山西 太谷 030801；3.山西農業大學 生命科學學院，山西太谷 030801）

為了順應國際、國內食品市場逐漸向營養型、功能型方向轉化需要，具有獨特營養品質和保健功能的農作物新品種選育、開發應用，成為新世紀農業增強國際競爭力的重要研究課題。維生素E 具有獨特的生理功能，對人體健康至關重要。研究表明，為保證人體肌肉、中樞神經系統等的正常生理功能，人體每天需要攝入7～9 mg 的α-生育酚，當α-生育酚攝入量達到100～1 000 mg 時可以有效預防衰老[1]。人體每天吸收適量維生素E 可有效預防和治療許多慢性病[2]，例如癌癥[3]、心血管疾病[4]、白內障[5]、眼部疾病[6]、肌肉膜修復[7]、肝功能[8]和肺功能[9]等，長期適度服用維生素E 可以增強人體的免疫功能[10]，降低氧自由基對神經元線粒體的損傷，在一定程度上保護膜脂不被破壞。

維生素E 最早發現于19 世紀，1922 年EVANS等[11]研究發現，給雌性老鼠喂食合成飼料時，發現一種脂溶性物質能夠有效地提高老鼠的生育能力，因此，又稱之為生育酚。天然存在的維生素E 有4 種生育酚（tocopherol）和4 種生育三烯酚（tocotrienol）共8 種類似物，其中，α-生育酚含量最高，生物活性也最高。天然維生素E 主要富含于大豆等油料作物種子中。大豆油脂中生育酚類的含量為0.09%～0.28%，其中，δ-生育酚占24.3%～36.2%，γ-生育酚占57.8%～65.7%，α-生育酚占6.0%～13.5%，β-生育酚含量極少（忽略不計），由于大豆籽粒中不含生育三烯酚，因此，維生素E 的含量常用上述3 種生育酚的總量來計算。隨著人們生活水平的提高，對維生素E 的需求將持續增加。因此，大豆生育酚組分研究及種質的篩選對于提高人民健康水平，增加我國農業的國際競爭力具有非常重要的意義。

目前，已有學者針對大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量開展了相關研究。趙霞等[12]采用高效液相色譜法（HPLC）測定8 個大豆品種生育酚組分含量，結果發現，HPLC 方法穩定、準確、可靠，并篩選出高α-生育酚含量的大豆品種SZ910；秦寧等[13]使用高效液相色譜法對維生素E 含量進行測定，將其聚為3 類，篩選出了組分含量高的種質10Q015；劉煥成等[14]測定不同大豆品種資源籽粒中的生育酚含量，結果發現，總生育酚含量在254 μg/g左右，且不同品種間含量存在較大差異。李海燕等[15]采用HPLC 方法分析黑龍江大豆品種合豐25與Bayfield 雜交構建的300 個RIL 家系生育酚含量，結果發現，各供試家系以哈爾濱地區大豆的籽粒生育酚含量最高；李桂華等[16]分析來自東北地區和黃淮流域的100 多份大豆資源生育酚含量，結果表明，東北地區大豆資源生育酚含量高于黃淮流域。由以上研究結果可見，大豆品種資源類型豐富，且籽粒生育酚含量相對較高，盡管目前已有學者針對少數大豆資源籽粒生育酚含量開展研究，但相較于大豆其他品質性狀的研究而言，報道甚少，且篩選出的優異種質遠不能滿足育種需要。

本研究通過對327 份大豆種質資源的維生素E及其生育酚含量進行檢測評價，篩選出富含維生素E 或生育酚的優質大豆資源，為大豆籽粒維生素E的生物強化和遺傳改良提供研究基礎和理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試327 份大豆種質資源（大部分來自于山西、山東、河南、河北、陜西、內蒙古等北方地區，少量來自于南方地區及國外地區）于山西省晉中市太谷縣申奉村種植，由山西農業大學遺傳與種質創新實驗室提供。

1.2 主要儀器

ATS.D5-2M 真空冷凍干燥機（北京Keyi 公司）；GT200 震動球磨儀（北京Grinoer 公司）；KM-300DE 超聲震蕩清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；MultiVap-8 平行濃縮儀（美國LabTech 公司）；QL-901 旋渦混合器（海門市Kylin-Bell 公司）；5810R 冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；J-SKY 分析天平（昆山巨天儀器設備有限公司J-SKY）等。

1.3 主要試劑

α-生育酚標準品、γ-生育酚標準品、δ-生育酚標準品，純度均≥98%（美國Solarbio 公司）；甲醇，為高效液相色譜級（美國Tedia 公司）；抗壞血酸、正己烷、乙醇，均為分析純（康為世紀生物科技有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 大豆維生素E 的提取 本研究采用溶劑提取法來提取大豆種質中的維生素E，將大豆成熟籽粒置于-20 ℃冰箱中保存24 h，放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥48 h，用震動球磨儀磨成粉狀置于密封袋中備用。稱取豆粉0.100 g 于離心管中。樣品中加入抗壞血酸0.125 g，再加入濃度為70%的乙醇3 mL，振蕩混勻30 s 后，在超聲波清洗器中提取20 min，后加入正己烷6 mL，振蕩混勻30 s 后，在超聲波清洗器中萃取15 min[17]。取出后于12 000 r/min離心8 min[17]。取上清液，使用平行濃縮儀，在氮氣條件下將溶液吹干，復溶于1 mL 甲醇中備用。

1.4.2 大豆維生素E 的測定 本研究采用改良高效液相色譜法（HPLC）測定大豆種質中α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚含量。色譜條件為：使用C18 色譜柱，柱溫35 ℃，檢測波長295 nm，流速1.0 mL/min，流動相為甲醇。

1.5 數據分析

采用SPSS 23 軟件進行數據分析，Excel 2010軟件繪制標準曲線，Originlab 軟件繪制正態分布圖及散點圖，Tbtools 繪制聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的確定及檢測

2.1.1 標準曲線與回歸方程的建立 設計5 個梯度的α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚濃度，利用HPLC測得峰面積，重復3次。分別以α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，得到α-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚的標準曲線與回歸方程。由表1可知，各生育酚標準品的線性回歸方程R2≥0.999 7，說明各生育酚質量濃度與峰面積的線性條件良好；經測定，α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品的檢出限分別為0.17、0.03、0.03 μg/g。

表1 生育酚標準品的回歸方程與檢出限Tab.1 Regression equation and detection limit of tocopherol standard

2.1.2 精密度和回收率的測定結果 分別將α-生育酚標準品、γ-生育酚標準品、δ-生育酚標準品稀釋到同一個濃度下，利用HPLC 測定其峰面積，重復進樣6 次，每次進樣量均為20 μL。通過計算α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚含量的理論值和測定值，得到回收率。從表2 可以看出，回收率均接近100%，均值在98%～99%，說明此方法可行，滿足檢測分析的基本試驗要求；計算α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品含量的相對標準偏差，結果表明，各生育酚標準品的RSD 范圍是1.06%～1.43%，說明維生素E 測定結果精密度高，可靠性好。

表2 回收率和精密度的測定結果Tab.2 Determination results of recovery rate and precision

2.2 大豆種質資源維生素E 及其組分含量分析

2.2.1 大豆種質資源維生素E 及其組分含量的描述性分析 從表3 可以看出，在327 份大豆種質資源中，α-生育酚含量的平均值為31.69 μg/g，變化范圍是9.84～168.13 μg/g，變異系數為74.99%；γ-生育酚含量的平均值為54.42 μg/g，變化范圍是15.06～89.54 μg/g，變異系數為20.01%；δ-生育酚含量的平均值為25.03 μg/g，變化范圍是3.78～46.92 μg/g，變異系數為30.42%；總維生素E 含量的 平 均 值 為111.14 μg/g，變 化 范 圍 是52.88～221.42 μg/g，變異系數為24.84%。

表3 大豆種質資源維生素E 及各組分含量Tab.3 Content of vitamin E and its components in soybean germplasm resources

結果表明，在327 份大豆種質資源中，γ-生育酚含量均值＞α-生育酚含量均值＞δ-生育酚含量均值；維生素E 各生育酚含量的變異系數均大于20%，α-生育酚含量的變異程度最大，δ-生育酚含量的變異程度次之，γ-生育酚的變異程度最小。

2.2.2 大豆種質資源維生素E 及其組分含量的分布特征 從圖1 可以看出，大豆籽粒中的維生素E及其組分α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量，在327 份種質資源中分布不一致。α-生育酚含量主要的分布范圍是10～30 μg/g；γ-生育酚含量的主要分布范圍是40～70 μg/g；δ-生育酚含量的主要分布范圍是20～30 μg/g；總維生素E 含量主要分布在83～138 μg/g。

α-生育酚含量的偏度為2.40，呈現正偏態分布；峰度為6.67，含量分布圖的峰態陡峭（圖1）。數據分布的左偏，即α-生育酚含量拖尾在右邊，峰尖在左邊，表示在327 份種質資源中，大部分大豆品種的α-生育酚含量較低。

圖1 大豆種質資源維生素E 及其各組分含量的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of vitamin E and its components in soybean germplasm resources

從圖1 可以看出，γ-生育酚含量在327 份大豆種質資源中基本呈正態分布。偏度為-0.28，峰度為0.40，因此，在327 份大豆種質資源中，γ-生育酚含量的數據分布對稱、峰態合適且服從正態分布。

從δ-生育酚的頻率分布直方圖（圖1）可以清晰地看出，δ-生育酚含量在327 份大豆種質資源中近似為正態分布。偏度為-0.01，峰度為0.27，均近似等于0。說明327 份大豆種質資源的δ-生育酚含量靠近平均值25.03 μg/g。

由圖1 可知，327 份大豆種質資源總維生素E 含量的頻率分布總體呈現數據分布左偏，偏度為0.94，說明總維生素E 含量在327 份大豆種質資源中的分布屬于正偏態分布；峰度為1.80，分布圖峰態陡峭，其總體分布情況與α-生育酚的含量分布相似。

2.2.3 大豆種質資源維生素E 及其組分含量之間的相關分析 由表4 可知，327 份大豆種質資源中α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量均與總維生素E 的含量存在極顯著正相關。根據相關系數可知，α-生育酚、γ-生育酚含量均與總維生素E 含量的相關系數較高，而δ-生育酚含量與總維生素E 含量之間相關系數相對較低。綜上結果表明，α-生育酚含量和γ-生育酚含量對327 份大豆種質資源中維生素E 的含量影響很大；δ-生育酚含量的影響較大。

表4 大豆種質資源維生素E 及其組分含量之間的相關系數Tab.4 Correlation coefficients of vitamin E and its components in soybean germplasm resources

本研究中，327 份大豆種質資源的維生素E 各生育酚含量之間的相關關系為：由假設檢驗可知，γ-生育酚的含量與α-生育酚、δ-生育酚的含量均呈極顯著正相關；由相關系數可知，γ-生育酚含量與α-生育酚含量之間相關系數為0.182，相關性強度為弱相關，γ-生育酚含量與δ-生育酚含量之間相關系數為0.438，相關性強度為低相關，而α-生育酚含量與δ-生育酚的含量之間相關系數為-0.100，相關性強度為弱相關。因此，327 份大豆種質資源中γ-生育酚含量與δ-生育酚含量之間相關性較強，而其余生育酚的含量間聯系不大。

2.2.4 大豆種質資源籽粒α-生育酚含量及比值的變化 目前，維生素E 含量是以α-生育酚為標準，因此，本研究分析了α-生育酚與（α+γ）/δ 和α/γ 值之間的關系，結果如圖2 所示。該群體的α/γ 值與α-生育酚含量間存在顯著正相關關系，α/γ 與α-生育酚之間的相關系數明顯高于（α+γ）/δ 與α-生育酚之間相關系數，且具有較高的相關系數；（α+γ）/δ 與α-生育酚之間相關性較弱。

圖2 大豆籽粒α-生育酚含量與生育酚比值的線性關系Fig.2 Linear relationship between α-tocopherol content and tocopherol ratio in soybean grains

2.2.5 大豆種質資源維生素E 及其組分含量的聚類分析 使用Tbtools 繪制聚類熱圖，如圖3 所示，其中，紅色越深，表示含量越高，藍色越深，表示含量越低。

圖3 大豆維生素E 各組分含量聚類分布Fig.3 Cluster distribution of vitamin E components in soybean

采用K-均值聚類法，按照327 份大豆種質資源的維生素E 或各生育酚的含量進行聚類分析，結果如表5 所示，第1 類群包括了99 份大豆材料，這一類群的維生素E 及其各組分含量的均值較其他類群來說均為最小值。第2 類群包括了9 份大豆材料，總體特征為α-生育酚含量（114.77 μg/g）和維生素E 總含量（197.50 μg/g）均達到最大值，其他性狀均介于均值。后期需選育α-生育酚較高的品種時，可選擇第2 類群。第3 類群包括了188 份大豆材料，占大豆種質資源的大部分。這一類群的δ-生育酚含量（27.00 μg/g）和γ-生育酚含量（60.05 μg/g）均達到最大值，其他性狀均介于均值。第4 類群共包括了31 份大豆材料，這一類群的維生素E 及其組分含量均介于均值，總體表現為各生育酚均含量較大，僅次于各性狀含量最大值的類群。

表5 2019 年自然群體維生素E 及其組分的聚類分析Tab.5 Clustering analysis of vitamin E and its components of natural population in 2019

2.2.6 優異種質資源維生素E 各組分含量的熱圖分析 為了更直觀地表現大豆種質資源中維生素E 各組分的含量差異。本研究選擇327 份大豆種質資源中的維生素E 含量較高的34 份大豆材料，對其各生育酚組分含量進行熱圖分析，如圖4 所示。

圖4 大豆種質資源維生素E 各組分含量的熱成像Fig.4 Heat map of vitamin E components in soybean germplasm resources

從圖4 可以看出，34 份大豆種質資源維生素E各組分含量差異用漸變的顏色表示，藍色代表各生育酚含量最低值，黃色為中間值，則紅色代表最高值。結果表明，SZ840 和SZ854 這2 個材料是α-生育酚含量較高，而γ-生育酚、δ-生育酚含量較低的材料。SZ823、WY75、SZ829這3個材料屬于α-生育酚含量較低，而γ-生育酚含量較高的材料。SZ975、SZ1020 這2 個材料是δ-生育酚含量較高的材料。還有一部分材料3 種生育酚含量都較高，如SZ956、SZ972、SZ967、SZ1020、SZ954。

3 討論

3.1 維生素E 提取和測定方法的優化

維生素E的提取方法有皂化法、酶解法、溶劑提取法、固相萃取法、加壓液相萃取法和超臨界流體萃取法等[18]。其中，溶劑提取法操作簡便，在常溫下就可提取到雜質較少、純度較高的維生素E，而且避免了劇烈的皂化反應，使得試驗結果準確度和精密度更高。

張小敏[19]使用ODS 色譜柱為固定相，使用甲醇和水（99∶1，V/V）作為流動相，可得到α-生育酚、（β+γ）-生育酚、δ-生育酚3 個峰。柳樹海等[20]使用ZorBax-C18 色譜柱為固定相，以甲醇為流動相，對天然生育酚進行分離，該方法操作簡便，重復性好。GLISZCZY?SKA-SWIGL 等[21]使 用Waters Symmetry C18 色譜柱作為固定相，使用甲醇和乙腈作為流動相，對食用油中的生育酚進行分離，該方法重現性好。劉煥成等[14]用C18 色譜柱作為固定相，以甲醇為流動相，測定不同大豆品種的α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量，并做了大豆維生素E 含量與其農藝性狀之間的相關性研究。本研究采用改良高效液相色譜法測定大豆種質資源中的維生素E 含量，對此方法進行精密度和回收率的測定，各生育酚標準品的RSD 范圍是1.06%～1.43%，回收率均值都大于98%。說明利用該方法檢測精密度高、效果好，可以用于維生素E 含量較高的大豆品種的篩選研究。

3.2 維生素E 及各組分含量的相關性分析

本研究通過對維生素E 及各組分進行相關性分析得出，除α-生育酚含量與δ-生育酚含量之間存在負相關外，其他性狀之間均呈現兩兩正相關，這與趙霞[22]研究結果一致。劉煥成等[14]研究結果表明，大豆中α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量均與維生素E 總含量存在極顯著正相關。MARIA等[23]對F2大豆種子研究發現，α-生育酚與γ-生育酚含量呈極顯著負相關，其他相關性之間均存在極顯著正相關。CURTIS 等[24]研究表明，α-生育酚與δ-生育酚之間表現為正相關性，其他結果與本研究結果基本一致。這些結果與本研究結果有所不同，可能與品種和環境因素有關。

本研究中，大豆資源的α/γ 值與α-生育酚含量之間存在顯著正相關，α/γ 值與α-生育酚含量之間的相關系數高于（α+γ）/δ 與α-生育酚含量之間相關系數，且具有較高的相關系數。這與PARK 等[25]研究野生大豆α-生育酚與（α+γ）/δ 和α/γ 間的相關性結果一致。由此說明，可以通過提高各生育酚的含量來增加維生素E 的含量，為富含維生素E 大豆品種的選育提供參考。

3.3 大豆種質資源維生素E 含量的評價與利用

維生素E具有多種營養和醫藥價值，是人類食品的重要成分。同時，有學者指出，相比于其他常見農作物而言，油料作物籽粒中的維生素E含量相對較高，因而，已成為食品和醫藥行業維生素E重要來源[26]。關于大豆品種資源籽粒維生素E含量鑒定及優異種質篩選，目前有少數學者已開展相關研究。羅健等[27]以東北三省及內蒙古大豆產區的180 份種質資源為材料，采用高效液相色譜技術檢測其籽粒維生素E及其組分含量，結果發現，供試大豆材料籽粒維生素E及其組分含量分布范圍在210～300 μg/g，且以合豐50 與L-21 的維生素E含量最高（分別為313.03、295.55 μg/g）。趙霞等[12]以8 份栽培大豆為材料，測定其籽粒維生素E組分含量，結果篩選出高α-生育酚含量大豆優異種質黑皮綠仁大豆SZ910。另外，李海燕等[15]、李桂華等[16]對百余份大豆種質資源進行籽粒維生素E含量測定，明確了供試材料維生素E含量水平的遺傳變異，但并未篩選優異種質。張章[28]和姜凌等[29]研究認為，維生素E 的生物強化和遺傳改良任務主要把握2 個方面：一方面是在作物的種子中提高維生素E 的總含量；另一方面是改變各生育酚的比例，并將作物種子中的其他生育酚都轉化為生物活性最高的α-生育酚。本研究中繪制的熱圖直接展示出這些優異種質各生育酚含量的差異，為大豆維生素E 的生物改善和強化提供便利。SZ840 和SZ854 這2 個材料是α-生育酚含量較高，而γ-生育酚、δ-生育酚含量較低的品種；SZ823、WY75、SZ829 這3 個品種屬于α-生育酚含量較低，而γ-生育酚含量較高的品種。這些品種均可以用于實現提高大豆維生素E 含量和改良大豆油脂品質的育種工作。本研究采用K-均值聚類法將327 份大豆種質資源進行分類，篩選出總維生素E 含量或各生育酚含量較高的34 份大豆種質資源，為進一步研究提供了基礎。

4 結論

本研究結果表明，經過改良的維生素E 提取和測定方法，回收率達到98.35%～99.00%，各生育酚標準品的RSD 范圍是1.06%～1.43%，說明此方法準確度高。在327 份大豆種質資源中，γ-生育酚含量均值＞α-生育酚含量均值＞δ-生育酚含量均值；維生素E 及其各生育酚含量的變異系數均大于20%；α-生育酚、總維生素E 的含量呈現正偏態分布，γ-生育酚、δ-生育酚的含量呈正態分布。327份大豆種質資源中α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量均與總維生素E 的含量存在極顯著正相關；γ-生育酚的含量與α-生育酚、δ-生育酚的含量均呈顯著性線性相關；對各組分進行聚類分析，篩選出34 份富含維生素E 的大豆品種，可為改良大豆品種提供研究基礎。本研究旨在充分挖掘大豆種質資源特性，為資源利用提供依據。