山西省馬鈴薯病毒病生物芯片檢測及分析

馮海旭，王新華，李 嬌，李 娟，孟 澤，曹 揮，馮 雪

（山西農業大學 植物保護學院，山西 太谷 030801）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）又名洋芋、土豆等，屬茄科多年生草本植物，原產于南美洲安第斯山區[1]，具有豐富的營養價值。馬鈴薯是世界第四大主糧作物，我國馬鈴薯種植面積和產量均位于世界前列[2]，山西省是我國中北部重要的馬鈴薯產區之一。根據山西省自然條件和馬鈴薯品種的特點，共劃分為3 個主要產區：晉北一季作區，包括懷仁、左云、岢嵐等地；晉中一二季混作區，包括左權、文水等地；晉南二季作區，包括沁源、蒲縣等地。

馬鈴薯在種植過程中易受到多種生物與非生物因素的影響，其中，病毒病是導致其質量與產量下降的主要因素[3]。馬鈴薯病毒病在我國各馬鈴薯主產地均能檢測到，受病毒侵染的馬鈴薯一般會減產10%～30%，危害嚴重時減產達80%以上甚至絕產[4-6]。被病毒侵染的馬鈴薯葉片通常出現花葉、黃化及皺縮等癥狀[7]，目前已經報道的馬鈴薯病毒有40 多種[8]，其中，較為常見且危害嚴重的有6 種病毒和1 種類病毒：馬鈴薯A 病毒（potato virus A，PVA）、馬鈴薯Y 病毒（PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯M 病毒（PVM）、馬鈴薯S 病毒（PVS）、馬鈴薯X 病毒（PVX）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）[9-10]。目前馬鈴薯病毒病的防治主要依靠脫毒種薯的種植和推廣，近年來山西省已經形成以山西省農業科學院高寒區作物研究所、薯類脫毒中心為核心，多個馬鈴薯脫毒種薯制種企業共同參與的種薯產業體系[11]。然而目前企業生產的脫毒種薯質量參差不齊，脫毒種薯對于農民的成本較高，以及種薯的推廣技術人員的缺乏等，使得脫毒種薯的全面種植依然存在許多問題。

馬鈴薯病毒病在全國廣泛存在，對馬鈴薯的質量和產量造成了嚴重損失。白艷菊等[12]研究表明，PVX 和PVY 分別是我國南部和北部的優勢病毒。陳瑩等[7]在浙江省7個地市的馬鈴薯種植區進行了馬鈴薯病毒檢測，共檢測到6種馬鈴薯病毒；魏瑤等[3]對內蒙古自治區馬鈴薯病毒病的檢測結果表明，PVY 是內蒙古馬鈴薯病毒病發生的優勢病毒，并且存在多種病毒復合侵染的情況。研究人員對我國青海省、福建省、云南省、甘肅省馬鈴薯病毒病的研究表明，田間普遍存在PVS、PVX、PLRV、PVA、PVM、PVY 等病毒，并且病毒的復合侵染嚴重[13-17]。

田間病毒調研時需要對大批量樣本進行快速、準確的病毒種類檢測和鑒定，所以，選擇合適的檢測方法至關重要。馬鈴薯病毒常見的檢測方法 有ELISA 和RT-PCR 法。1972 年，ENGVALL和PERLMANN 首 次報 道 了ELISA 的 方 法[18]，但ELISA 對病毒的檢測需要與之相對應的特異性抗體，所以，無法在一次反應中實現多種病毒的同時檢測；同時由于類病毒本身只含有核酸而沒有蛋白質，無法實現和抗體的特異性結合，所以，不可用于類病毒的檢測。PCR是1985年美國科學家MULLIS等[19]發明的一種特異性體外擴增DNA 的技術，由于植物病毒多數是以單鏈RNA 的形式存在，需要將RNA 逆轉錄為互補DNA（complementary DNA）后再進行后續的擴增，即通常采用RT-PCR，此方法在單次試驗中同時檢測多種病毒時，引物的設計難度較大，且隨著引物數量的增加，相互間造成的干擾會使引物特異性隨之下降，易影響復合侵染樣品檢測的靈敏性和準確性。生物芯片技術檢測病毒擁有極高的靈敏度，生物芯片利用樣本提取的核酸RNA，由PCR 將其生物信號放大到230倍，再利用專一性探針進行結合檢測，其靈敏度比以上檢測方法（ELISA 或RT-PCR）高，用時短且結果肉眼可見，具有可操作性強、綜合成本較低等優點[20]。Gene Top PVB-ⅣKit 可對馬鈴薯常見的7 種病毒（PVA、PVM、PVS、PVX、PVY、PLRV、PMTV）與1 種類病毒PSTVd，以及Ech（Erwinia chrysanthem）（菊歐氏桿菌）等4 種主要危害馬鈴薯的細菌進行快速精準的檢測，對復合侵染嚴重的樣品具有檢測優勢。

山西省是北方馬鈴薯主產區之一，馬鈴薯是山西省重要的糧食作物，但是目前還沒有對山西省馬鈴薯病毒病發生、分布有全面檢測的報道，也少見對山西省馬鈴薯病毒病的相關研究。本研究通過對山西省晉北、晉中和晉南3 個馬鈴薯主產區8 個主產地采集的疑似被病毒病侵染的馬鈴薯樣品進行生物芯片檢測，明確了山西省馬鈴薯主產區病毒種類及發生分布情況，旨在為山西省馬鈴薯質量的監測、評價、病毒病的防控提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試馬鈴薯樣品采集信息如表1 所示。

表1 供試馬鈴薯樣品采集信息Tab.1 Collection information of potato samples tested

1.2 方法

2019—2020 年5 月，在山西省晉北、晉中、晉南3 個馬鈴薯主產區的8 個縣采集癥狀為花葉、皺縮、黃化等疑似被病毒侵染的馬鈴薯葉片樣品319 份（表1），采集后將樣品放入采樣袋后置于4 ℃冰箱暫存待用。

本研究使用馬鈴薯病原菌芯片（Ⅳ）檢測套組（巨合生物科技股份有限公司），按操作要求[20]檢測樣品感染病原菌情況。具體試驗方法參照說明書進行。

1.3 數據分析

試驗采用Microsoft Excel 2010 進行數據統計和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯病毒病的癥狀

2019—2020 年在山西省晉北的左云、岢嵐、懷仁、嵐縣，晉中的文水、左權，晉南的蒲縣、沁源，3 個馬鈴薯主產區的共8 個馬鈴薯主產地采集表現為花葉、皺縮、黃化等癥狀的樣品（圖1）。

圖1 田間馬鈴薯病毒病癥狀Fig.1 Symptoms of potato virus diseases in the fields

2.2 生物芯片檢測結果

2.2.1 檢出病毒種類及檢出率 對山西省8 個馬鈴薯主產地采集的全部樣品芯片檢測結果表明（表2），319 份樣品中，檢測到陽性樣品共305 份，共檢測到5 種病毒和1 種類病毒，分別為PVY、PLRV、PVM、PVS、PVX 和PSTVd，病毒總檢出率為95.61%；采集樣本中PVY 發生率最高，共檢出280 份，總檢出率87.77%；其次是PLRV，共檢測到140 份，總檢出率為43.89%；PVM、PVS 和PSTVd總檢出數依次減少，分別為114、70、6 份，總檢出率分別為35.74%、21.94%和1.88%；采集樣本中檢出數目最少的是PVX，僅1 份，檢出率僅為0.31%，沒有檢測到PVA 和馬鈴薯帚頂病毒（potato moptop virus，PMTV）的存在。

表2 山西省馬鈴薯病毒/類病毒分布及檢測結果Tab.2 Distribution and detection results of potato viruses/viroid in Shanxi province

續表2 山西省馬鈴薯病毒/類病毒分布及檢測結果Tab.2（Continued） Distribution and detection results of potato viruses/viroid in Shanxi province

本次生物芯片檢測到的所有馬鈴薯病毒如圖2所示，其中圖2-Ⅰ的注1 表示無效數據，注2 情況可直接判讀結果；圖2-Ⅱ為本次樣本中檢測到的所有馬鈴薯病毒病的侵染類型：A.PVM；B.PVYN+PVS；C. PVM+PVS；D. PVY-N+PVS+PLRV；E. PVY-N+PVM+PLRV；F. PVY；G.PVY-N+PVM+PVS+PLRV； H. PVY-N+PLRV；I.PVS+PLRV；J.PVY+PVM+PLRV+PSTVd；K. PVM+PVX；L. PVY-N+PLRV+PSTVd；M. PLRV；N. PVM+PVS+PSTVd；O.PVY+PVM+PVS；P. PVM+PLRV；Q. PVYN+PVM；R.PVY-N。

圖2 全部樣本生物芯片檢測結果Fig.2 All samples detection results of biochip

2.2.2 各主產區病毒檢出情況及危害程度 山西省晉北、晉中及晉南3 個馬鈴薯主產區的病毒檢出率分別為95.56%、94.29%、97.10%，相比之下，晉南地區馬鈴薯病毒病發生較為嚴重，晉北和晉中地區次之。8 個縣馬鈴薯主產地采集的樣本中被馬鈴薯病毒侵染的檢出率在90.00%～97.83%，晉北4 個縣馬鈴薯病毒病發生最為嚴重的是懷仁，病毒總檢出率為97.83%，并且在懷仁檢測到本研究中的5 種病毒和1 種類病毒均有存在；其余發生嚴重程度依次為左云、岢嵐、嵐縣，檢出率分別為95.56%、95.45%、93.33%；馬鈴薯病毒病在晉中的文水和左權的檢出率分別為97.50%和90.00%；在晉南的沁源和蒲縣的檢出率分別為97.44%和96.67%。根據檢測結果，檢出率均≥90.00%，說明全省范圍內馬鈴薯上的馬鈴薯病毒病發生都較為嚴重。

2.2.3 檢出病毒在各主產地的發生情況 在晉北、晉中以及晉南的8 個馬鈴薯主產地檢出的5 種病毒和1 種類病毒中，PVY、PLRV、PVM 和PVS 在本次所有采樣地均有發生，其中，PVY 檢出率最高和最低分別出現在文水和嵐縣，檢出率分別為97.50%和77.78%；PLRV 檢出率最高和最低分別出現在嵐縣和文水，檢出率分別為66.67% 和20.00%；PVM 檢出率最高和最低分別出現在嵐縣和文水，檢出率分別為73.33%和17.50%；PVS 檢出率最高和最低分別出現在嵐縣和沁源，檢出率分別為28.89%和15.38%；PSTVd 僅檢出6 份，檢出率為1.88%，其中，懷仁3份，岢嵐、文水、沁源各1份；PVX 僅在懷仁檢出1 份，檢出率為0.31%。結果表明，每種病毒在各地侵染情況差異較大。

2.2.4 病毒的單獨侵染及復合侵染情況 通過對8 個馬鈴薯主產地采集的319 份樣品進行生物芯片檢測結果（圖2-Ⅱ）表明，陽性樣品存在單獨侵染以及2 種或多種病毒復合侵染的情況，病毒存在單一侵染和多種病毒復合侵染的不同組合（表3），檢測到有3 種病毒存在單獨侵染、2 種病毒復合侵染的組合7 種，3 種病毒復合侵染的組合5 種，4 種病毒復合侵染的組合2 種，其中，芯片檢測結果PVY 和PVY-N 型均歸為PVY。芯片檢測結果表明，田間絕大多數馬鈴薯植株并不只是被一種馬鈴薯病毒單獨侵染，同時還存在被多種病毒復合侵染。本研究的319 份檢測樣品中，病毒單侵染樣品共122 份，總檢出率為40.00%，PVY、PLRV、PVM 在田間均檢測到單獨侵染的情況：PVY 114 份，檢出率為35.74%；PLRV 1 份，檢出率為0.31%；PVM 7 份，檢出率為2.19%。復合侵染包括2、3、4 種病毒復合侵染：2 種病毒復合侵染的組合有7 種，共93 份，總檢出率為29.15%，分別為PVY+PLRV、PVY+PVM、PVM+PLRV、PVY+PVS、PVS+PVM、PVM+PVX、PVS+PLRV，其中，檢出率最高的是PVY+PLRV，共檢測到53 份，檢出率為16.61%；3 種病毒復合侵染的組合有5 種，共57 份，總檢出率為17.87%，分別為PVY+PVM+PLRV、PVY+PVS+PLRV、PVM+PVS+PVY、PVY+PLRV+PSTVd、PVM+PVS+PSTVd，其中，檢出率最高的是PVY+PVM+PLRV，共檢測到28 份，檢出率為8.78%；4 種病毒復合侵染的組合有2 種，共33 份，總檢出率為10.34%，分別為PVY+PVS+PVM+PLRV 和PVM+PVY+PLRV+PSTVd，分 別 檢測到30、3份，檢出率分別為9.40%和0.94%。芯片檢測結果表明，單一病毒侵染樣本數＞2 種＞3 種＞4 種病毒復合侵染，但多種病毒復合侵染總檢出率為60.00%，大于單一病毒侵染的總檢出率。多種病毒復合侵染類型中，2 種病毒復合侵染樣本數和組合數在復合侵染中占比最多，是復合侵染的主要類型。對數據進一步統計分析發現，PVY 不僅在單一侵染中占比最高，在本研究的14 種病毒復合侵染類型共183 份樣本中，PVY 參與的復合侵染樣本共166 份，同樣占比最高。說明PVY 是山西省優勢病毒，田間侵染馬鈴薯的病毒主要以復合侵染的形式存在。

表3 田間馬鈴薯病毒/類病毒的單獨侵染以及復合侵染情況Tab.3 The condition of single and co-infection of potato virus/viroid in the fields

3 結論與討論

本研究對山西省晉北、晉中、晉南8 個馬鈴薯主產地的馬鈴薯病毒病發生情況進行調研，通過生物芯片檢測技術對采集的319 份疑似病樣進行檢測，共檢測到305 份陽性樣品，總檢出率為95.61%，晉北、晉中以及晉南3 個馬鈴薯主產區的病毒檢出率在94.29%～97.10%，其中，晉南地區病毒發生最為嚴重，3 地共檢測到5 種馬鈴薯病毒和1 種類病毒，每種病毒檢出率排序依次為PVY＞PLRV＞PVM＞PVS＞PSTVd＞PVX，其中，PVY 的檢出率最高，是侵染山西省馬鈴薯的優勢病毒。各主產地都存在多種病毒復合侵染的情況，并且占比較大，其中，懷仁縣檢測出病毒的種類最多，涵蓋本次檢測的全部病毒和類病毒。

根據我國各地的馬鈴薯病毒檢測結果表明，多數地區PVY 為侵染馬鈴薯的優勢病毒，各地基本都存在PVS、PLRV 等馬鈴薯常見病毒。郭喜文[21]對山西省馬鈴薯病毒進行了檢測，但采樣的馬鈴薯產區局限于山西省北部，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定的方法（Double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA）對PVY、PVS、PVX、PLRV、PVA 以及PVM 進行檢測，結果表明，PVY 和PVS 是限制山西省北部馬鈴薯生產的主要病毒。與前者的檢測相比，本研究采樣地點更廣，覆蓋山西省晉北、晉中和晉南的馬鈴薯主產區；同時芯片檢測技術可檢測的病毒種類更多，還可以檢測1 種類病毒和4 種細菌；所以，從檢測種類和地域覆蓋性上，結果更具代表性。郭喜文[21]研究表明，馬鈴薯病毒檢出率從大到小依次為PVY（17.85%）＞PVS（5.95%）＞PLRV（2.64%）＞PVX（1.32%）＞PVM（0.47%）＞PVA（0.09%）；本研究的病毒檢出率排序為PVY（87.77%）＞PLRV（43.89%）＞PVM（35.74%）＞PVS（21.94%）＞PSTVd（1.88%）＞PVX（0.31%）。對山西省馬鈴薯病毒檢測2 次結果比較表明，PVY在山西省的發生率仍為第一，但病毒發生程度有所改變，PVY 發生率較之前升高了69.92%；PLRV、PVM、PVS 的檢出率均較2011 年調研顯著提高，PLRV 和PVM 超越PVS 成為主要病毒；本研究中PVX 僅檢出1 份；檢測到1 種類病毒PSTVd，檢出率為1.88%。郭喜文從天鎮縣檢測出1 份PVA，而本研究采集樣本中沒有檢測到PVA 的存在。

山西省晉北、晉中、晉南的8 個馬鈴薯主產地馬鈴薯病毒侵染嚴重，存在單病毒侵染和多種病毒復合侵染，其中，3 種病毒單獨侵染占陽性樣本的比例達40.00%，病毒復合侵染占陽性樣本的比例高達60.00%。郭喜文[21]共檢測到6 種單獨侵染的病毒、由2 種病毒復合侵染的組合6 種、由3 種病毒復合侵染的組合2 種；本研究共檢測到3 種單獨侵染的病毒、由2 種病毒復合侵染的組合7 種、由3 種病毒復合侵染的組合5 種、由4 種病毒復合侵染的組合2 種；相比之前，病毒復合侵染組合更加復雜多樣，多病毒復合侵染可使發病癥狀更加明顯，對產量的影響更大，嚴重制約山西省馬鈴薯產業的發展。

傳統的馬鈴薯檢測方法具有耗時長、檢測樣本數量受限、操作復雜、成本高等缺點，不適用于大批量樣本的同時檢測，不便于對田間馬鈴薯進行快速檢測、監測和評價。崔紅紅等[22]通過采集155 個馬鈴薯樣本，對湖南省種薯質量和病毒病的發生情況進行檢測。穆艷娥等[23]通過DAS-ELISA 的方法檢測到6 種馬鈴薯病毒；2 項研究使用了RT-PCR和DAS-ELISA，但是該技術對于大批量的樣本檢測不具有優勢。盧麗麗等[24]通過馬鈴薯病原菌芯片檢測，評價了云南大田馬鈴薯種薯和商品薯繁育質量，該試驗通過大量采集馬鈴薯樣品進行檢測，共檢出5 種馬鈴薯常見病原菌，可見通過生物芯片檢測技術可以實現快速、準確、大量的對目標馬鈴薯樣本的檢測，對馬鈴薯的監測、檢測和評價具有重要作用。

本研究通過馬鈴薯病芯片檢測技術對山西省晉北、晉中及晉南的8 個馬鈴薯主產地進行馬鈴薯病毒病全面準確的檢測，明確了病毒的發生分布情況，結果表明，全省馬鈴薯病毒病的發生均較為嚴重。應加強種薯質量把控，提高抗病育種水平，加大對蚜蟲等傳毒介體的監測和防控，采用科學合理的耕作制度，才能有效控制馬鈴薯病毒病在田間的發生和傳播，提高山西省馬鈴薯的質量和品質。