基于DNA 甲基化鑒定口腔鱗狀細胞癌預后生物標志物

王婷婷，溫凌杜，王子弘，李孔亮，古妍琪，楊宏宇

（1.北京大學深圳醫院口腔醫學中心，廣東 深圳 518000；2.深圳市寶安婦幼保健院口腔科，廣東 深圳 518000；3.南方醫科大學公衛學院，廣東 廣州 510000）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見的癌癥之一，每年影響約超過40 萬人[1]。盡管近幾十年來診斷和治療方法不斷更新，但由于OSCC 具有高復發率和高頸部淋巴結轉移的風險，導致OSCC 的預后并沒有明顯改善，5 年總生存率仍為45%～50%[2]。因此，有必要進一步闡明OSCC 的發病機制，以挖掘潛在的生物標志物以改善預后。DNA 甲基化是表觀遺傳修飾的重要表現形式，可影響血管生成、細胞周期的調控或DNA 損傷修復等多個方面[3]，而異常的DNA 甲基化與腫瘤發病機制和癌癥患者的生存率顯著相關[4]。因此，本研究應用生物信息學方法分析OSCC 樣本的DNA 甲基化高通量微陣列信息，并分別進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析、蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI） 網絡和Cytoscape軟件的MCODE 模塊分析以及生存分析，以期鑒定出OSCC 差異甲基化區域（differentially Methylated Region，DMR）中與預后相關的關鍵基因，并初步探究其在OSCC 中的作用機制，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 數據下載與整理 在GEO 數據庫中以“Methylation，450k，OSCC”為檢索條件，篩選并下載DNA 甲基化分析數據集GSE87053，平臺信息為GPL13534 IlluminaHumanMethylation450 BeadChip （Human－Methylation450_15017482），共包含21 個樣本，其中正常樣本10 例，OSCC 樣本11 例。

1.2 數據處理與DMRs 的篩選 應用R 軟件（V 3.6.1）minfi、impute、wateRmelon、IlluminaHumanMethylation450kmanifest、IlluminaHumanMethylation450kanno.ilmn12.hg19 和cluster 包對數據行歸一化處理及質控，進一步以qvalue ＜0.05 作為具有統計學差異的閾值篩選出差異甲基化位點（differentially methylated position，DMP），最后以“cutoff=0.2，B=100，type=Beta”為設置條件，以fwer＜0.05 作為具有統計學差異的閾值，將DMPs 聚類以得出DMRs。

1.3 DMRs 的基因注釋 將DMRs 數據提交至wANNOVAR，以注釋出DMRs 中所包含的基因。

1.4 GO 與KEGG 通路富集分析 為明確DMRs 中所包含基因的生物學特性，通過DAVID 數據庫行GO和KEGG 通路富集分析，其中GO 富集分析包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF） 和生物過程（biological process，BP）。結果均以Pvalue＜0.05 為有統計學差異。

1.5 PPI 網絡的構建與關鍵基因的鑒定 為在蛋白質水平上進一步探索DMRs 中所包含基因間的關聯，將DMRs 中所包含的基因映射到STRING 數據庫中，并同時去除無關聯基因以及將interaction score≥0.4 作為閾值，來評估這些基因間的相互作用關系。進一步應用Cytoscape 軟件（V 3.6.1）中的MCODE（V 1.6.1）模塊，以“degree cutoff=2，max.Depth=100，k-core=2，node score cutoff=0.2”為設置條件，對PPI 網絡進行聚類以發現密集的連接區域，并鑒定出PPI 網絡中的關鍵基因。

1.6 OSCC 關鍵基因的預后相關性分析 通過GEPIA數據庫行OSCC 關鍵基因的Kaplan-Meier 分析，明確關鍵基因表達與OSCC 患者總生存期（overall survival，OS）的相關性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DMPs 與DMRs 的篩選 由圖1 可見，GSE87053數據集經過R 軟件minfi、impute 等包處理后Beta中位值位于同一水平，并篩選出cg05068636、cg17477990 和 cg13260377 等 93 650 個 DMPs（qvalue ＜0.05），見表1；聚類得出chr6（start 31696223～end 31696729）、chr2（start 54086854～end 54087343）和chr1（start 25257624～end 25258146）等168 個DMRs（fwer＜0.05）見表2。

表1 差異甲基化位點前10 位

表2 差異甲基化區域前10 位

圖1 數據歸一化處理及質控

2.2 DMRs 的基因注釋 將168 個DMRs 數據提交至wANNOVAR 工具中，共注釋得到194 個基因信息，見表3。

表3 其中10 位差異甲基化區域的基因注釋

2.3 GO 與KEGG 通路富集分析 為闡明DMRs 中包含的194 個基因的生物學特性，通過DAVID 數據庫行GO 與KEGG 通路富集分析。GO 分析結果表明（P＜0.05），BP 的變化在轉錄、DNA 模板化和RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正負調控等條目顯著富集；MF 的變化主要集中在轉錄因子活性、序列特異性DNA 結合和氨基酸跨膜轉運蛋白活性等條目；CC 的變化主要集中在轉錄抑制復合物和樹突。KEGG 通路富集分析結果表明（P＜0.05），主要富集于癌癥通路、慢性粒細胞白血病、胰島素信號通路和Notch 信號通路，見圖2。

圖2 差異甲基化區域基因的GO 和KEGG 通路富集分析

2.4 PPI 網絡分析與關鍵基因的鑒定 DMRs 中包含的194 個基因的PPI 網絡在去除無關聯基因后，共由56 個節點和53 條邊緣組成（interaction score≥0.4），見圖3A。通過Cytoscape 軟件的MCODE 模塊聚類出具有高度連通性的連接區域（degree cutoff=2，max.Depth=100，k-core=2，node score cutoff=0.2），見圖3B，可見CTBP1、RUNX1、NCOR2、CTBP2 和HDAC4 可作為OSCC 的關鍵基因，可能在OSCC 患者的DNA 甲基化中起重要作用。

圖3 差異甲基化區域基因的PPI 網絡

2.5 OSCC 關鍵基因的預后相關性 通過GEPIA 數據庫行關鍵基因的Kaplan-Meier 分析，明確CTBP1、RUNX1、NCOR2、CTBP2 和HDAC4 的表達與OSCC 患者預后間的關系。結果顯示，CTBP1 和HDAC4 與OSCC 患者的OS 相關（P＜0.05），見圖4。

圖4 OSCC 關鍵基因的預后分析

3 討論

既往研究已發現多種類型的表觀遺傳修飾，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑等，其中DNA 甲基化可通過調節細胞中基因的表達影響細胞增殖、細胞周期和細胞分化等多種生物學過程[5]?？梢姡珼NA 甲基化的失調可能會導致腫瘤抑制因子的沉默或癌基因的表達，進而導致腫瘤的發生和發展[6]。近年來，學者們已開始通過DNA 甲基化來不斷闡明OSCC 的發病機制，以尋找潛在的生物標志物。在OSCC 中已證明，LATS1 和LATS2 的甲基化失調可影響細胞周期的調控以及DDR 信號的傳導[7]，PAX1 和ZNF582 的高甲基化狀態與腫瘤細胞的侵襲性進展相關[8]。但目前的研究尚缺乏使用數據分析來篩選和鑒定用于預測OSCC 預后的生物標志物。因此，本研究擬通過生物信息學方法分析GEO數據庫中OSCC 患者的高通量微陣列芯片測序信息，以期鑒定出參與OSCC 表觀遺傳調控的潛在關鍵基因，并明確其在預后評估中的臨床價值。

本研究首先基于GEO 數據庫中的DNA 甲基化微陣列數據集GSE87053，分析了11 例OSCC 樣本和10 例正常樣本的DNA 甲基化信息，篩選出93 650 個DMPs 和168 個DMRs，通過基因注釋發現DMRs 中 的 DDAH2、GPR75 -ASB3、RUNX3 和SLC7A5 等194 個的基因。GO 和KEGG 通路富集分析結果發現，這些基因可影響轉錄因子及其活性并參與癌癥和Notch 信號通路的調節，并且已有研究表明Notch 信號可通過誘導上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）從而促進OSCC 的轉移[9]?？梢?，這些基因的生物學特性與OSCC 的發病機制密切相關。進一步PPI 網絡分析顯示了基因之間的功能連通性，其中CTBP1、RUNX1、NCOR2、CTBP2 和HDAC4 可作為基于DMRs 分析的OSCC關鍵基因，但在最后的預后分析中只有CTBP1 和HDAC4 顯示出與患者OS 的相關性。

羧基末端結合蛋白1（C-terminal binding protein1，CTBP1）是轉錄共阻遏蛋白CTBP 的家族成員之一，可在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下形成同源二聚體或異源二聚體，通過將HDAC、LSD1 和G9a 等表觀遺傳修飾酶募集到靶基因特定的啟動子或增強子區域，以在致癌機制中發揮調控細胞遷移、細胞侵襲和EMT 等不同功能[10]。在胃癌中，CTBP1作為miR-539-3P 的直接靶標，其高表達可通過促進EMT 和調控腫瘤細胞的增殖和侵襲以加速疾病進展[11]。在乳腺癌中，高表達的CTBP1 還被證明可通過激活RAD51 的轉錄從而增加腫瘤細胞對順鉑的抗性[12]。但值得注意的是，在肺腺癌中過表達的CTBP1 與較差的總體存活率密切相關[13]。這與本研究基于GEPIA 數據庫研究發現OSCC 中高表達的CTBP1 與較長的OS 相關相悖，考慮到Takayama K等[14]的研究發現在雄激素受體陽性前列腺癌細胞中CTBP1 可表現出腫瘤抑制作用，因此，CTBP1 在OSCC 中所扮演的角色仍需進一步研究闡明。組蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）為IIa 類組蛋白去乙酰化酶之一，存在于轉錄輔抑制因子復合物中，可與組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferases，HAT）控制組蛋白的乙?；癄顟B，在染色質的維持和功能中發揮重要作用[15]。在癌癥中HAT 和HDAC4 間的平衡被改變，從而導致對細胞侵襲、細胞遷移和細胞增殖等方面的異常調節[16]。如HDAC4 mRNA 和蛋白質在食管鱗狀細胞癌組織和細胞系中呈高表達，通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21 和p27 以及上調CDK2/4 和CDK依賴性Rb 磷酸化來促進腫瘤細胞的增殖和G1/S細胞周期進程，并與較高的腫瘤分級、晚期臨床分期和較差的生存率相關[17]。另外在Wang Z 等[18]研究中也發現，HDAC4 蛋白在肝細胞中過度表達且與患者的不良生存率有關。但本研究發現HDAC4 在5 年生存率上其高表達組卻表現出更長的OS，與在其他類型腫瘤中的研究結果相悖，可見其在OSCC 中的調控機制仍需進研究深入探討。

綜上所述，本研究基于公開的DNA 甲基化數據行生物信息學分析發現，CTBP1 和HDAC4 或可作為OSCC 中潛在臨床靶標和預后生物標志物。但尚存在一定的局限性，研究僅基于對全球公開數據庫的部分數據進行分析，對于CTBP1 和HDAC4 在結合國人OSCC 患者數據中的表達以及預后情況的相關研究仍為空白區域，因此有必要進一步進行體外和體內基礎實驗，以更好地了解在我國OSCC患者中CTBP1 和HDAC4 的DNA 甲基化改變的影響和潛在機制，以及通過病例對照研究和前瞻性試驗評估驗證候選的生物標志物，但本研究中的數據或可為OSCC 潛在分子標志物和靶點的研究提供新的思路。