九龍?zhí)倏傸S酮通過lncRNA MIAT 調(diào)控自噬對大鼠急性心肌梗死的影響

陳卉彬，簡 潔

（桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541199）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于冠狀動脈急性、延續(xù)性缺血和缺氧所致的心肌壞死，為臨床常見的突發(fā)疾病，其死亡率較高[1]。現(xiàn)如今中醫(yī)藥對AMI 有良好的治療效果[2]，但對現(xiàn)有藥物的研究大多停留在藥效階段，缺乏對其作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制的深入探討。九龍?zhí)贋槎箍浦参稞堩毺賉Bauhinia championii（Benth.）Benth.]的干燥根或莖，含有豐富的黃酮類化合物，其提取物的藥理作用主要體現(xiàn)在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗凝血等方面[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)[4-7]，九龍?zhí)倏傸S酮（Bauhinia Championii flavone，BCF）對垂體后葉素所導(dǎo)致的急性心肌缺血有保護(hù)作用，可激活PI3K/Akt 信號通路抗心肌缺血/再灌注損傷，并抑制自噬，減輕心肌細(xì)胞缺血/缺氧損傷。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過20 個核苷酸、缺乏蛋白質(zhì)編碼潛能的內(nèi)源性RNA分子。lncRNA 在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8-11]。研究表明[12]，被稱為心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（Myocardial infarction associated transcript，MIAT）的lncRNA 可能在心肌梗死的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮部分作用。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)[13]，敲低MIAT 表達(dá)可影響自噬，從而保護(hù)CCA 誘導(dǎo)的心肌肥厚，因而推測BCF 的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)MIAT 表達(dá)抑制自噬有關(guān)。本研究通過建立大鼠心梗模型探討B(tài)CF 通過MIAT 調(diào)控自噬對AMI 的影響，以期為防治AMI新藥研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠50 只，體重為200～240 g，由湖南斯萊克景達(dá)動物有限公司提供[許可證號碼：SCKX（湘）2019-0004]。于桂林醫(yī)學(xué)院藥理教研室分籠飼養(yǎng),溫度24 ℃～26 ℃，濕度50%～60%,12 h/12 h 明暗周期，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 材料 BCF（本室分離純化，總黃酮含量以蘆丁計為85%）；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥工業(yè)公司上海第八制藥工廠，批號：71C805）；Gluta 固定液（北京索萊寶有限公司，批號：20220209）；Trizol 試劑（北京天根公司，批號：W0222）；EasyScript ○ROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，批號：O11208）；Perfect－StartTM Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，批號：P41014）；大鼠cTn-Ⅰ試劑盒（武漢華美生物公司，批號：Z21019821）；所有引物購自上海生工生物工程股份有限公司；GAPDH和Cathepsin D 抗體（Proteintech Group，批號：10020246、00058789）；LC3 抗體（Elabscience，批號：DQ0262）；超微量核酸定量儀（Thermo Scientific,型號：NanoDrop One）；實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，型號：CFX96TM Real-Time System）；免疫印跡化成像系統(tǒng)（Bio-Rad，型號：ChemiDocTMXRS+）；小動物呼吸機(jī)（美國CEW 公司，型號：SAR-1000）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 隨機(jī)選取雄性SD 大鼠，分為sham 組、AMI 組、BCF 組，除假手術(shù)組外，其余各組采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法制備大鼠心肌缺血模型，缺血24 h 后進(jìn)行l(wèi)nc RNA 基因檢測。設(shè)計并合成lnc RNA MIAT si-RNA，將雄性SD 大鼠分為si-NC 組、si-MIAT 組、BCF+si-NC 組和BCF+si-MIAT 組，按實驗分組制備大鼠心肌缺血模型（缺血24 h）。si-NC、si-MIAT、BCF+si-NC、BCF+si-MIAT 組于造模前24 h 心肌注射MIAT 及其對照（NC）si-RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，BCF、BCF+si-NC、BCF+si-MIAT 組于造模前30 min 給予BCF（20 mg/kg）預(yù)處理。

1.3.2 HE 染色 造模結(jié)束后，心臟用4%多聚甲醛固定，通過梯度濃度的酒精脫水并嵌入石蠟中包埋。將包埋好的組織切成5 μm 厚的切片，在二甲苯中脫蠟，然后重新脫水，隨后進(jìn)行HE 染色。應(yīng)用正置顯微鏡觀察切片。

1.3.3 血清cTn-Ⅰ含量測定 造模結(jié)束，各組動物經(jīng)心尖取血1 ml，10 000 r/min 離心20 min，取上清液，按大鼠cTn-Ⅰ試劑盒說明書檢測血清中cTn-Ⅰ含量。

1.3.4 透射電鏡 取動物心臟組織，用預(yù)冷的PBS 沖洗，切成2 mm 的立方體，4 ℃下固定過夜。乙醇梯度脫水后，進(jìn)行包埋固化，隨后將組織切片為90～100 nm 厚的薄片。組織染色后安裝在200 目銅絲上，用JEM1200EX 透射電鏡進(jìn)行成像。

1.3.5 RT-qPCR 用Trizol 試劑從組織中提取總RNA，合成第一鏈cDNA。按照SYBR Green QPCR Master Mix 說明書進(jìn)行PCR 定量。數(shù)據(jù)分析采用GAPDH 作對照基因，2-△△CT方法計算基因表達(dá)量，引物序列見表1。

1.3.6 Western blot 各組動物在造模結(jié)束后取心臟，用預(yù)冷的生理鹽水充分洗凈殘血，取結(jié)扎線以下左心室組織，用RIPA（北京索萊寶公司）裂解總蛋白并定量，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜橫流260 mA，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光，采用Image J 軟件測其灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素分析，組內(nèi)比較采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIAT 在AMI 大鼠中的表達(dá)情況 AMI 組MIAT表達(dá)高于Sham 組，而AMI+BCF 組MIAT 表達(dá)低于AMI 組（P＜0.05），見圖1。

圖1 MIAT 在AMI 大鼠中的表達(dá)情況

2.2 各組大鼠心臟組織HE 染色結(jié)果分析 AMI+si-NC 組的心肌細(xì)胞減少且肥大，心肌纖維斷裂且散亂排列，細(xì)胞間隙變寬；與AMI+si-NC 組比較，AMI+si-MIAT 組和AMI+BCF+si-NC 組細(xì)胞心肌細(xì)胞程度肥大減輕，排列較整齊。同時，AMI+BCF+si-MIAT組病理變化較AMI+BCF+si-NC 組有一定程度的改善，見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織的HE 染色結(jié)果（×400）

2.3 各組血清cTn-Ⅰ含量比較 AMI+si-MIAT 組、AMI+BCF+si-NC 組 和AMI+BCF+si-MIAT 血 清cTn-Ⅰ含量低于AMI+si-NC 組（P＜0.05）；同時，AMI+BCF+si-MIAT 組血清cTn-Ⅰ含量低于AMI+BCF+si-NC 組（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠血清中cTn-Ⅰ含量比較

2.4 各組大鼠心臟組織自噬小體透射電鏡結(jié)果分析AMI+si-NC 組自噬小體數(shù)量高于AMI+si-MIAT 組和AMI+BCF+si-NC 組，且相較于AMI+BCF+si-NC組，AMI+BCF+si-MIAT 組自噬小體的數(shù)量也有所減少，見圖4。

圖4 各組大鼠心臟組織自噬小體透射電鏡結(jié)果（×20 000）

2.5 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)基因表達(dá)比較 AMI+si-NC 組Beclin1、Cathepsin D、LC3 表達(dá)高于AMI+si-MIAT 組、AMI+BCF+si-NC 組、AMI+BCF+si-MIAT 組（P＜0.05）；而AMI+BCF+si-MIAT 組Beclin1、Cathepsin D、LC3 表達(dá)低于AMI+BCF+si-NC 組（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)基因表達(dá)比較

2.6 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 AMI+si-NC 組Beclin1、Cathepsin D、LC3 的蛋白表達(dá)高于AMI+si-MIAT 組、AMI+BCF+si-NC 組、AMI+BCF+si-MIAT 組（P＜0.05）；而AMI+BCF+si-MIAT組Beclin1、Cathepsin D、LC3 的蛋白表達(dá)低于AMI+BCF+si-NC 組（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

AMI 是一種可由缺血性心臟病或冠狀動脈疾病共同引起的疾病，當(dāng)動脈粥樣硬化斑塊破裂，形成的血凝塊完全或部分堵塞冠狀動脈，限制了流向心臟的血液時，AMI 就會發(fā)生并伴有心源性休克等并發(fā)癥，病情險惡、死亡率高[14]。在臨床上，通常通過手術(shù)或冠狀動脈介入來疏通堵塞的血管，以恢復(fù)心臟的血流，但由此產(chǎn)生的缺血再灌注損傷和手術(shù)并發(fā)癥限制了治療的整體效果。因此，需要采取有效的治療方法。

據(jù)報道[15]，中藥會影響血小板聚集、循環(huán)、氧化應(yīng)激、血管反應(yīng)性和其他心血管特性。中藥也在AMI的治療中積累了豐富的經(jīng)驗。白曉君等[16]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮可以PI3K/Akt/VEGF 細(xì)胞信號通路促進(jìn)缺血性心肌的血管再生。九龍?zhí)偈菑V西的特色中藥材，其性平、無毒、資源豐富，含有豐富的黃酮類化合物和皂甙，具有祛風(fēng)除濕、化瘀、活血、止痛等作用。本課題組前期實驗也表明[4]，BCF 對垂體后葉素所致的急性心肌缺血具有明顯的保護(hù)作用。另有研究表明[17-20]，lncRNA 在心衰、心肌肥大、心肌缺血/再灌注損傷等心血管疾病中發(fā)揮著重要作用。lncRNA MIAT 是一種跨物種的lncRNA，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肺和脾臟中表達(dá)，被認(rèn)為在多種疾病中發(fā)揮重要作用[21]。有報道稱[22]，MIAT 的表達(dá)在缺氧細(xì)胞中上升，并與SF1 結(jié)合，抑制CGRP 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致AMI。同時，它還是臨床診斷急性心肌梗死的潛在新生物標(biāo)志物[23]。本研究建立了動物AMI 模型，RT-qPCR 檢測心臟組織中MIAT 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)的心肌梗死模型中，MIAT 表達(dá)上調(diào)，BCF 預(yù)處理可下調(diào)缺血心肌MIAT 基因水平。同時，沉默MIAT 與BCF 預(yù)處理可降低血清中的心肌缺血損傷的標(biāo)志物cTn-Ⅰ含量，從而減輕AMI。自噬是一種代謝過程，老化或受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被分解成氨基酸和脂肪酸，用于能量生產(chǎn)和回收[24，25]。它響應(yīng)于營養(yǎng)缺乏或代謝應(yīng)激而被激活，以維持組織功能和體內(nèi)平衡[26]。許多研究已經(jīng)揭示了自噬在AMI 中的功能，心臟自噬的過度激活會對急性心肌梗塞產(chǎn)生不良影響[27]。因此，抑制自噬可能是治療缺血性心臟病的一個策略。實驗也表明[9]，BCF 通過抑制自噬，改善心肌缺血損傷。本研究結(jié)果顯示，沉默MIAT 可促進(jìn)BCF 對自噬的抑制作用，如減少自噬小體的數(shù)量、下調(diào)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ比率和Beclin1、Cathepsin D 的表達(dá)，可見BCF 通過介導(dǎo)MIAT 影響AMI 誘導(dǎo)的自噬。

綜上所述，BCF 預(yù)處理下調(diào)MIAT 基因表達(dá)，提示MIAT 是BCF 治療心臟AMI 的潛在靶點(diǎn)。