納米氧化銅與納米氧化鐵懸浮液對黃瓜霜霉病的抗性與防效

王志恒，韓家晨，徐雯琦，陳曉峰

(中國農業大學 煙臺研究院，山東 煙臺 264670)

0 引言

【研究意義】黃瓜是南北方廣泛種植的蔬菜作物，種植過程中極易受病蟲害危害，尤以真菌病害的影響最嚴重，其中較常見的病害有霜霉病〔Pseudoperonosporacubensis(Berk.et Curt.)Rostov.〕、蔓枯病〔Mycosphaerellamelonis(Pas.)Chiu et walker.〕、炭疽病〔Colletotrichumorbiculare(Berk aLMont) Arx.〕和白粉病〔ErysiphecichoracearumZheng & Chen,Sphaerothecacucurbitae(Jacz.) Z.Y.Ahao〕[1-2]。霜霉病又稱跑馬干，是一種通過空氣傳播的毀滅性葉部病害，發生于黃瓜苗期至成熟期，發病后若控制不當，易導致黃瓜大量減產甚至絕收，嚴重威脅黃瓜的安全生產。目前采取的主要防止手段是品種更新和藥物防治[3-5]，藥物以化學農藥為主，但長期使用易造成病毒的耐藥性增強，且會帶來一系列環境問題[6]。所以，減少低效、高毒且高殘留化學農藥的使用，尋求新型防止藥物是農業現階段發展的必由之路，對蔬菜安全生產和農業綠色生態具有重要現實意義。【前人研究進展】納米材料被譽為21世紀的“高科技材料”，其對促進植物生長和提高植物抗病性有顯著作用。SWIFT等[7]研究發現，納米二氧化鈦(5 nm)可以促進光吸收，植物的光合效率提高9.8%～21.6%。WANG等[8]報道，納米銀(5 nm、10 nm)使用濃度為 0.01 mg/L和0.05 mg/L時能夠促進擬南芥的生長；納米銀(25 nm)使用濃度為 1 mg/L時可促進楊樹生長。ADISA等[9]研究發現，納米二氧化鈰(8 nm)能抑制番茄枯萎病的發生并提高植物葉綠素含量。王志靜等[10]認為，納米銀(10 nm)和納米銅(10 nm)的單劑防治柑橘青霉菌有明顯效果，其EC50分別為2.456 6 mg/L和1.196 2 mg/L。王運強等[11]研究發現，低濃度納米氧化銅對西瓜幼苗生長有顯著調節作用。劉振國等[12]報道，納米氧化銅處理紫花苜蓿根系的SOD、POD及CAT等抗氧化酶活性達最高，對根系活力影響顯著。邱凌之等[13]研究發現，50 mg/L納米氧化鐵對番茄具有促生長效應。【研究切入點】國內外學者圍繞納米材料生理效應進行了大量研究，然而運用納米材料針對黃瓜霜霉病防治方面的相關研究尚不多見。【擬解決的關鍵問題】在黃瓜真葉期采用葉面噴霧法，研究不同濃度納米氧化銅(CuO NPs)和納米氧化鐵(Fe2O3NPs)懸浮液噴施后再接種霜霉病病原菌黃瓜葉片丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和葉綠素(Chl.a+Chl.b)含量的變化，以及對黃瓜霜霉病的防治效果，以期為黃瓜生產中應用納米材料防控黃瓜霜霉病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃瓜 品種為津春四號，中國農業大學煙臺研究院提供。

1.1.2 藥劑 納米氧化銅(CuO NPs，20 nm)、納米氧化鐵Fe2O3NPs，20 nm)，購自上海攀田粉體材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理

1) 育苗。黃瓜種子采用55℃溫水進行溫湯浸種，穴盤育苗，待植株長至4葉一心時選擇長勢一致、健壯且無病的幼苗備用。

2) 霜霉病病原菌(Pseudoperonosporacubensis)接種液制備。試驗于2021年2—6月在中國農業大學煙臺研究院進行。從日光溫室內取回自然發病的黃瓜霜霉病病葉，在適宜條件下用毛刷子蘸取無菌水刷取發病黃瓜葉片上新鮮的分生孢子，紗布過濾后用無菌水稀釋，在顯微鏡下計數制成濃度為1×106個/mL的分生孢子懸浮液。

3) 納米懸浮液制備。根據王建榮等[14]的方法，在超純水中按比例分別加入CuO NPs (A)和Fe2O3NPs (B)顆粒，超聲1.5 h制備成濃度為10 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的懸浮液，備用。

1.2.2 試驗設計 試驗設7個處理，根據CuO NPs 和Fe2O3NPs 的處理濃度(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)分別設3個處理(A1～A3和B1～B3)，以噴施超純水作對照(CK)，每處理6株幼苗，3次重復。用微型噴霧器將納米材料懸浮液均勻噴灑在葉片正反面，每處理約用懸浮液40 mL，噴灑至懸浮液即將開始滴落為止；24 h后再將病原菌接種液均勻噴灑到黃瓜葉片背面，每處理約需接種液15mL，噴灑至懸浮液即將開始滴落為止；套黑色塑料袋在25～28℃黑暗環境中保濕48 h后去袋。

1.2.3 指標測定

1) 發病情況。在病原菌接種7 d后對黃瓜霜霉病發病情況進行調查。參照中華人民共和國國家標準《農藥田間藥效試驗準則(一)殺菌劑防治黃瓜霜霉病》[15]規定的病害調查分級標準，各小區隨機取4個樣點，每點調查2株黃瓜，每株調查全部葉片。根據病斑面積占整個葉面積的百分率分級：0級，無病斑；1級，病斑面積占整片葉面積的5%以下；3級，病斑面積占整片葉面積的6%～10%；5級，病斑面積占整片葉面積的11%～20%；7級，病斑面積占整片葉面積的21%～40%；9級，病斑面積占整片葉面積的40%以上。根據所得數據計算病情指數和防治效果。

病情指數=∑(各級病葉數×相對級數值)/(調查總葉數×9)×100%

防治效果=[1-(CK0×PT1)/(CK1×PT0)]×100%

式中，CK0為對照組施藥前的病情指數，CK1為對照組施藥后的病情指數，PT0為試驗組施藥前的病情指數，PT1為試驗組施藥后的病情指數。

2) 丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量。參照李合生等[16-18]的方法，分別在接種病原菌0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后隨機選擇黃瓜葉片，測定丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量。

3) 葉綠素含量。參照LICHTENTHALER[19]的紫外吸收法進行測定。首先，在接種病原菌14 d后取50 mg新鮮黃瓜葉片樣品，切成約1 cm的碎塊，加入15 mL試管中，用10 mL丙酮-乙醇提取液(V∶V=1∶1)進行修正，加塞。然后在黑暗避光中保存72 h，用紫外可見分光光度計在波長664.2 nm和664.2 nm分別測定吸光度值(A)，計算葉綠素A、葉綠素B和總葉綠素含量。

葉綠素A含量=13.36A664.2-5.19A648.6

葉綠素B含量=27.43A648.6-8.12A664.2

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2016記錄數據并計算繪圖；采用SPSS 26.0對試驗數據進行Duncan’s新復極差法比較和差異顯著性檢驗(P≤0.05)。

2 結果與分析

2.1 2種納米材料處理黃瓜葉片霜霉病的病情指數及防治效果

從表1看出，CuO NPs和Fe2O3NPs懸浮液處理黃瓜霜霉病的病情指數和防治效果均存在差異。

2.1.1 病情指數 CuO NPs處理的黃瓜霜霉病病情指數為2.03～4.68，Fe2O3NPs處理的病情指數為2.90～4.63。表明，2種納米材料處理黃瓜霜霉病的病情指數均顯著低于CK(12.73)。

2.1.2 防治效果 CuO NPs處理的防治效果為40.75%～72.23%，隨CuO NPs濃度增大防治效果呈先升后降趨勢，表現為A2>A3>A1。其中，A2的防治效果最好，為72.23%，顯著高于A1和A3，較A1提高31.48百分點；A3的防治效果為51.46%，較A2降低20.77百分點，且葉片出現發黃萎蔫。Fe2O3NPs處理的防治效果為58.73%～71.24%，隨Fe2O3NPs濃度增大防治效果呈逐漸上升趨勢，表現為B3>B2>B1。其中，B3的防治效果為71.24%，較B1和B2分別提顯著高12.51百分點和10.84百分點；B1與B2的防治效果差異不顯著。表明，50 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs 的防治效果最好。

表1 不同納米材料處理黃瓜霜霉病的病情指數及防治效果

2.2 2種納米材料處理黃瓜葉片的MDA含量

由圖1可知，2種納米材料處理不同時段黃瓜葉片的MDA含量存在差異。

2.2.1 CuO NPs 在接種霜霉病病原菌后CuO NPs各處理的MDA含量隨時間延長均呈上升趨勢，且均在96 h時達最高。0 h時各處理的MDA含量表現為CK>A1>A3>A2，其余時段均表現為A3>CK>A1>A2，A1和A2的MDA含量較CK低，A2較A1低，說明10 μg/mL和50 μg/mL納米懸浮液對黃瓜霜霉菌有較好的抑制效果，且50 μg/mL的抑菌效果更加明顯。

2.2.2 Fe2O3NPs 在接種霜霉病病原菌后Fe2O3NPs各處理的MDA含量隨時間延長均呈上升趨勢，且在96 h時達最高。0 h時各處理的MDA含量均表現為CK>B1>B2>B3，且同一濃度處理72 h與96 h的MDA含量無顯著差異(除處理B3間差異顯著外)；48 h及以后，同一時段下隨著Fe2O3NPs濃度增大，MDA含量均較CK顯著降低。當Fe2O3NPs濃度為100 μg/mL時，接種病原菌96 h后，黃瓜葉片中MDA含量較CK降低43.3%。

注：圖中不同小寫字母表示各處理間差異顯著 (P≤0.05)。下同。

2.3 2種納米材料處理黃瓜葉片的GSH含量

由圖2可知，2種納米材料處理不同時段黃瓜葉片的GSH含量存在差異。

2.3.1 CuO NPs 各處理不同時段黃瓜葉片GSH含量均隨CuO NPs濃度升高呈先升后降趨勢，表現為A2>A1>A3>CK；在0 h之后各處理GSH含量與CK均差異顯著，其中，A2的GSH含量提升最明顯，A1次之，A3的效果最差且在處理48 h時葉片出現萎蔫發黃現象。隨處理時間延長，CK的GSH含量呈逐漸下降趨勢，A1、A2和A3的GSH含量均呈先升后降趨勢，均在72 h達峰值，隨后迅速下降，96 h時GSH含量與48 h時的水平接近。

2.3.2 Fe2O3NPs 各處理不同時段黃瓜葉片GSH含量呈現與CuO NPs處理不同的上升趨勢，即前72 h GSH含量呈顯著上升趨勢，但96 h時各處理的GSH含量與72 h時無明顯變化。0 h之后各處理GSH含量均表現為B3>B2>B1>CK；隨處理時間延長，CK和B1的GSH含量呈逐漸下降趨勢，B2和B3的GSH含量均呈逐漸上升趨勢。與CK相比，B1的GSH含量較CK略有提高，B2和B3較CK提高顯著。說明霜霉病菌的侵染造成黃瓜葉片GSH含量的下降，B1能緩解病原菌侵染造成的GSH含量下降，而B2和B3的GSH含量顯著上升，且后者作用效果更明顯。

圖2 納米氧化銅和納米氧化鐵處理黃瓜葉片的GSH含量

2.42種納米材料處理黃瓜葉片的葉綠素含量

從表2看出，2種納米材料處理14 d后黃瓜葉片葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量的變化。

2.4.1 CuO NPs 各處理黃瓜葉片的葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量分別為0.742～1.043 mg/g、0.196～0.372 mg/g和0.938～1.415 mg/g，均表現為A1>A2>CK>A3，即隨處理濃度升高葉綠素含量呈先升后降趨勢。其中，A1最高，A2其次，二者差異顯著，且均顯著高于CK，說明該濃度處理對霜霉病病菌有抑制作用，且在A1時更有利于葉綠素的合成。A3黃瓜葉片的葉綠素a含量顯著低于CK，下降9.842%；其葉綠素b和總葉綠素含量均較CK低，分別下降7.981%和9.459%，但差異均不顯著。

2.4.2 Fe2O3NPs 各處理黃瓜葉片的葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量分別為0.903～1.174 mg/g、0.270～0.362 mg/g和1.173～1.536 mg/g，均表現為B2>B3>B1>CK，即隨處理濃度增大黃瓜葉綠素含量呈顯著上升趨勢，未出現中高濃度抑制的現象。其中，B3最高，顯著高于其余處理；B2其次，顯著高于B1和CK。B3黃瓜葉片的葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量較CK分別上升62.69%、69.95%和48.36%，說明，霜霉病病原菌侵染對葉綠素含量的影響受到明顯抑制。

表2 納米氧化銅和納米氧化鐵處理黃瓜葉片的葉綠素含量

3 討論

當前蔬菜病害已成為制約蔬菜產業發展的重大問題，其中卵菌門病害對蔬菜生產造成的損失尤為嚴重，特別是黃瓜霜霉病菌對一般化學藥劑已普遍產生抗藥性[20-21]，致防治困難。研究發現，CuO NPs和Fe2O3NPs對黃瓜霜霉病均具有良好的抑制效果。不同濃度CuO NPs和Fe2O3NPs懸浮液處理可降低黃瓜葉片的病情指數，且在一定濃度范圍內，濃度越大效果越明顯。但100 μg/mL CuO NPs懸浮液處理葉片出現萎蔫現象，究其原因是過高濃度的納米材料對黃瓜具有細胞毒性，與張慧玲[22]研究的高濃度納米材料對植物有負面效應的結論一致。

丙二醛(MDA)含量通常表示膜脂過氧化程度和膜的損傷程度[11]，膜脂過氧化程度越劇烈，MDA含量越高，則膜損傷越大。隨著CuO NPs和Fe2O3NPs懸浮液處理時間的增加，黃瓜葉片的MDA含量較CK逐漸下降，膜系統受損程度和膜脂過氧化程度較CK下降；谷胱甘肽(GSH)被認為是植物活細胞體內最重要的氧化還原緩沖劑，對應急條件下高活性氧水平和產生的氧化應激和損傷進行解毒[23]。試驗中GSH含量較CK逐漸提高，但CuO NPs處理96 h時的GSH含量呈下降趨勢，而Fe2O3NPs處理未出現下降趨勢，與趙銘等[24]的研究即多種酶聯合作用清除活性氧導致酶含量降低的結果一致。與Fe2O3NPs處理不同的是，當CuO NPs懸浮液處理濃度過高時，抗氧化酶系活力升高[12]，納米材料對黃瓜葉片產生的氧化脅迫相應增加，在100 μg/mL時對黃瓜葉片造成氧化損傷，傷害植株。

研究結果表明，一定濃度納米材料處理后可提高葉綠素含量，其中10 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs懸浮液處理的效果最好，而100 μg/mL CuO NPs懸浮液處理黃瓜葉片出現黃化萎蔫現象，說明100 μg/mL CuO NPs懸浮液已對黃瓜葉綠素合成產生抑制，高濃度納米懸浮液的積累對黃瓜生長產生毒害，與王發園等[25-26]的研究結果相似。所以，黃瓜葉片對納米氧化銅的耐性比對納米氧化鐵的耐性更弱，此結果進一步驗證楊遠強[27]對CuO NPs在植物耐性中的研究結果。目前還無法準確判斷黃瓜對CuO NPs和Fe2O3NPs的耐受特性是否高于其他納米材料，未來將繼續開展試驗及細胞學相關研究。

4 結論

CuO NPs和Fe2O3NPs有效減輕黃瓜霜霉病的發生，在適宜濃度范圍內，CuO NPs和Fe2O3NPs的防效分別為40.75%～72.23%和58.73%～71.24%；同時，除100 μg/mL CuO NPs處理外，二者均可提高病菌侵染后的葉綠素含量和GSH含量(除CuO NPs處理GSH含量在病原接種后96 h受抑制外)，降低MDA含量，能促進黃瓜光合作用及降低膜脂過氧化程度。其中，50 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs對黃瓜霜霉病病原菌的抗菌效果最佳；100 μg/mL CuO NPs懸浮液處理對黃瓜葉片產生毒害，進而對霜霉病菌的抑制效果顯著減弱。在施用時應根據種植條件控制施藥濃度，避免施加納米氧化銅濃度過大對黃瓜生長產生損害，影響施用效果和產品收益。