冬蟲夏草提取液對60Co γ 射線輻照小鼠睪丸組織氧化損傷的保護作用

魏閃閃，王婷，彭偉彪，汪家春，馮旭，蘇笠，儲智勇，張陣陣

目前，電離輻照已廣泛應用于工業、農業和醫學領域，然而電離事故及放射醫療不可避免地對人體造成傷害，引起急性輻照綜合征［1］。在電離輻照過程中，放射源在組織內呈指數衰減的形式分布，因此，入射通道的正常細胞及組織均會受到一定程度的損傷，可能引起并發癥［2］。水是細胞的主要成分，電離輻照作用于水分子后，產生2 個初級自由基（OH-和H＋），進而引起了一系列自由基鏈式反應，產生多種自由基，特別是輻照后細胞代謝產物活性氧（ROS）作用于線粒體膜電位，促使細胞的生理生化發生改變，誘導生物大分子的破壞、失活，甚至是細胞的凋亡［2-3］。已有研究結果表明，電離輻照導致的DNA 損傷90%是由自由基造成的，因此，清除自由基氧化損傷是防輻照損傷的重要途徑之一［3］。

外源性損傷修復藥物主要通過直接清除體內自由基來保護機體，進而有效減少輻照損傷［4］。一些中藥及其中的活性成分通過減少輻照或光解水產生的OH-自由基，防止自由基對機體產生氧化損傷，從而具有良好的抗氧化功效［5］。因此，開發新的天然輻照防護劑及其活性成分不僅具有廣泛的應用前景，而且具有重點開發的科學價值。

作為最早收載冬蟲夏草的國家，中國首次于公元8 世紀的《月王藥診》中記載冬蟲夏草具有治療肺部疾病的功效［6］。隨后，《千萬舍利》《四川通志》《藥性考》及《景岳全集》等記載冬蟲夏草性溫暖，秘精益氣，專補命門，能益腎補腎，化痰止咳［7-8］。現代藥理學研究表明，冬蟲夏草具有抗腫瘤、保護小腦、抗肝纖維化、抗衰老、保護胃和抗糖尿病、壯陽、抗疲勞、免疫調節等多種功效［9-11］。冬蟲夏草雖已有上千年的用藥歷史，但對其功效的研究依然處于初步階段。本研究測定了輻照小鼠睪丸組織中抗氧化酶活性、脂質過氧化物產物含量、氧化酶相關的基因表達等，初步探討了冬蟲夏草提取液（Cordyceps sinensisexact，CSE）對輻照誘導小鼠睪丸組織氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品 野生冬蟲夏草產自青海玉樹，購買于雷允上藥業集團有限公司，由海軍軍醫大學藥學院黃寶康教授鑒定為真品。CSE 采用了水提法進行制備［12］，由海軍特色醫學中心（原海軍醫學研究所）制劑室提供（批號：20161201）。

1.1.2 實驗動物 50 只SPF 級C57BL/6 雄性小鼠（體重20～25 g）購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2013-2016。所有小鼠放置溫度為22～26 ℃、濕度為44%～65% 的室內動物房中進行飼養，并給予正常飲食、飲水，飼養1 周以適應生長。本次實驗已通過海軍軍醫大學倫理委員會審核，且相關操作均遵守實驗動物管理規范和適用原則。

1.1.3 動物分組 50 只SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，按數字表法隨機分為未輻照組（Control 組）、輻照組（Model 組）、低劑量CSE（CSE-L）組（生藥劑量312.5 mg/kg）、中劑量CSE（CSE-M）組（生藥劑量625.0 mg/kg）和高劑量CSE（CSE-H）組（生藥劑量1 250.0 mg/kg），共5 組，每組各10 只。

1.1.4 試劑 生理鹽水（批號：160530D13）購于黑龍江福和華星制藥集團股份有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（S0131）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（S0101）、4%的多聚甲醛（P0099）均購于碧云天生物科技有限公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）一抗購買于Cell Signaling Technology；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real v Time）（RR036A）、RNAiso Plus（9109）均購于Takara；SybrGreen qPCR Master Mix（QR-SG-M200）購于Rainbio 公司。

1.1.5 實驗儀器 ECLIPSE TI-SR 倒置熒光顯微鏡（日本NIKON 公司）；ECLIPSE C1 正置熒光顯微鏡（日本NIKON 公司）；SpectraMax M5/M5e 多功能酶標儀（美國分子儀器公司）；CFX96 Touch 定量PCR 儀（美國Bio-rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立電離輻照損傷模型 除Control 組外，其余4 組小鼠均放置于塑料盒中固定，給予單次8 Gy60Co γ 射線全身輻照（輻照率為0.96 Gy/min）。輻照4 h 后，CSE-L、CSE-M 與CSE-H 組灌胃給予相應生藥劑量的CSE，Control 及Model 組小鼠給予等體積量的生理鹽水。所有小鼠在相同的實驗環境下，每日于14:00 進行灌胃給藥/生理鹽水1 次，共持續28 d。在此次實驗過程中，Control、CSE-M 及CSE-H 組小鼠均未出現死亡現象，Model 組小鼠死亡4 只，CSE-L 組小鼠死亡1 只。

1.2.2 標本收集 各組小鼠灌胃給藥/生理鹽水28 d 后，3% 水合氯醛麻醉小鼠，切開陰囊后，將2 只睪丸取出并用生理鹽水洗滌干凈，1 只保存于4% 體積分數的多聚甲醛中，另1 只液氮速凍后放于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 睪丸組織中MDA 水平的檢測［13］取（20 ±2）mg 睪丸組織，加入200 μl 蛋白裂解液至細胞粉碎機中研碎，離心，收集上清中的蛋白提取液。聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白濃度測定試劑盒檢測待測樣品中的蛋白濃度。根據說明書將蛋白裂解液/標準品/待測樣品、MDA 檢測工作液加入至0.6 ml 的PCR 管中，加熱15 min，冷卻，離心半徑8.6 cm，離心力（RCF）為1 000×g，離心10 min，取200 μl 各組上清至新的平底96 孔板，放入Spectra-Max M5/M5e 多功能酶標儀中，分別測定各孔溶液在532 nm 處的吸光度。按照該試劑盒說明書畫出標準曲線，并分別計算各組樣品中MDA 水平。

1.2.4 睪丸組織中SOD 活力的檢測［13］取（10 ±2）mg 睪丸組織，加入100 μl SOD 樣品制備液至細胞粉碎機中研碎，RCF 為12 000×g（離心半徑8.6 cm），離心10 min 后取上清作為待測樣品。按照說明書將各組待測樣品/SOD 檢測緩沖液、對應濃度的WST-8/酶工作液、反應啟動工作液加入至96 孔板中。在37oC 環境下孵育30 min 后，放入Spectra-Max M5/M5e 多功能酶標儀中測定樣品管與對照管450 nm 處的吸光度。分別計算各組樣品中SOD 活力。結果顯示，CSE-H 組小鼠睪丸組織中的SOD 活力顯著性高于Model 組（P＜0.05），而CSE-L 組及CSE-M 組與Model 組相比差異無統計學意義（P＞0.05），因此，本研究后續將進一步采用了蘇木精伊紅（HE）及TUNEL 染色、qRT-PCR、Western blotting實驗對Control、Model、CSE-H 組小鼠的睪丸組織進行了檢測。

1.2.5 HE 染色檢測小鼠睪丸組織形態［14］取出的睪丸組織多聚甲醛固定后，經TP1020 自動脫水機脫水，進行石蠟包埋，EG 1150C 超薄切片機上做超薄石蠟切片、烤片、切片透明化、脫蠟、HE 染色、封片。將處理好的切片至倒置熒光顯微鏡，并采集Control 組、Model 組、CSE-H 組小鼠睪丸組織HE 切片圖像。

1.2.6 MPO 染色檢測小鼠睪丸組織炎性浸潤細胞數目［14］將石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化酶，血清封閉，孵育一抗、二抗、二氨基聯苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色，復染細胞核，脫水封片后，放于熒光顯微鏡下，圖像采集分析Control 組、Model 組、CSE-H 組小鼠睪丸組織MPO 圖像。

1.2.7 qPCR 檢測睪丸組織中凋亡相關基因的表達［11］取（10 ± 2）mg 睪丸組織，放于1 ml 的Trizol中，用細胞粉碎機進行研碎。加入200 μl 氯仿，充分漩渦，靜置，離心取上清并加入等量的異丙醇，上下顛倒混勻后靜置，離心棄上清。用無酶的75%乙醇溶液洗滌3 次，干燥，加入適量的無酶DEPC 水，混勻。根據RNA 濃度將各組的RNA 進行定量，逆轉錄形成cDNA 后，于96 孔PCR 板中進行qPCR，計算Control 組、Model 組、CSE-H 組小鼠睪丸組織中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）及聚ADP-核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase1，PARP1）基因的表達。引物序列見表1。

表1 PCR 起始序列（primer sequence）

1.3 統計學處理

采用Graphpad 7.0 軟件對實驗數據進行分析，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CSE 對60Co γ 射線輻照誘導小鼠睪丸組織中MDA 水平及SOD 活力的影響

與Control 組相比，Model 組小鼠睪丸組織MDA水平提高，SOD 活力降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與Model 組相比，CSE-L、CSE-M、CSE-H 治療組中MDA 水平呈劑量依賴性明顯降低（P＜0.01）；CSE-H 治療組中SOD 活力升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 CSE 對60Co γ 射線輻照小鼠睪丸組織中MDA 水平及SOD 活力的影響（± s）

表2 CSE 對60Co γ 射線輻照小鼠睪丸組織中MDA 水平及SOD 活力的影響（± s）

注：與Control 組相比aP＜0.05，bP＜0.01；與Model 組相比cP＜0.05，dP＜0.01。CSE 為冬蟲夏草提取液，MDA 為丙二醛，SOD 為超氧化物歧化酶；L、M、H 分別代表低、中、高劑量

SOD 活力（units）0.59±0.02 0.32±0.03b 0.31±0.02b 0.38±0.02b 0.44±0.02ac組別Control 組Model 組CSE-L 組CSE-M 組CSE-H 組例數10 69 10 10 MDA 含量（μmol/mg）340.9±9.0 1 105.0±44.5b 815.5±33.1bd 588.7±36.2ad 447.6±12.0d

2.2 CSE 對60Co γ 射線輻照誘導小鼠睪丸組織HE病理學的影響

HE 病理結果顯示，Control 組小鼠睪丸組織中生精管膜完整，曲細管、精管間的間質組織結構緊密，排列整齊，層次較清晰，精子較豐富。Model 組小鼠睪丸組織間質結構變疏松，間質細胞不同程度地變性，同時，生精上皮明顯變薄，腔內空虛。CSE-H 組睪丸組織的形態完整，結構緊密。見圖1。該結果提示CSE可以緩解由輻照引起的睪丸組織結構損傷。

圖1 CSE 對60Co γ 射線輻照誘導小鼠睪丸組織病理學的影響（HE×200）

2.3 CSE 對60Co γ 射線輻照誘導小鼠睪丸組織MPO 病理學的影響

MPO 染色結果顯示，Control 組、Model 組、CSEH 組小鼠睪丸組織中MPO 陽性細胞數目分別是7.667 ± 1.453、38.000 ± 2.887、18.000 ± 1.732。與Control 組相比，Model 組中小鼠睪丸組織中炎癥細胞浸潤數目顯著增加（P＜0.01）；與Model 組相比，CSE-H 組中小鼠睪丸組織MPO 陽性細胞數目明顯降低（P＜0.01）。結果提示高濃度CSE 能有效抑制由輻照引起的睪丸組織中炎性細胞浸潤的發生。

圖2 CSE 對60Co γ 射線輻照誘導小鼠睪丸組織病理學的影響（MPO×400）

2.4 CSE 對60Co γ 射線輻照誘導小鼠睪丸組織中PARP1、GSH-Px、CAT 基因mRNA 相對表達量的影響

與Control 組相比，Model 組中小鼠睪丸組織中PARP1 基因mRNA 相對表達量明顯上升（P＜0.01）,GSH-Px、CAT 基因mRNA 相對表達量明顯降低（P＜0.01）。與Model 組相比，CSE-H 組中GSH-Px 基因mRNA 相對表達量明顯上調，PARP1 基因mRNA 相對表達量明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表3。該實驗結果表明，CSE 能有效地改善上述與凋亡相關的基因表達。

表3 CSE 對60Co γ 射線輻照誘導小鼠睪丸組織中PARP1、GSH-Px、CAT 基因mRNA 相對表達量的影響（± s）

表3 CSE 對60Co γ 射線輻照誘導小鼠睪丸組織中PARP1、GSH-Px、CAT 基因mRNA 相對表達量的影響（± s）

注：與Control 組比較aP＜0.01；與Model 組比較bP＜0.01。CSE為冬蟲夏草提取液，PARP1 為聚ADP-核糖聚合酶1，GSH-Px 為谷胱甘肽過氧化物酶，CAT 為過氧化氫酶，H 代表高劑量

CAT 1.04±0.05 0.56±0.06a 0.70±0.03a組別Control 組Model 組CSE-H 組例數10 6 10 PARP1 1.01±0.04 10.36±0.51a 7.21±0.79ab GSH-Px 1.02±0.07 0.66±0.04a 0.87±0.03b

3 討論

電離輻照的應用是把雙刃劍，在廣泛應用于農業、工業、醫學、軍事等領域的同時，電離事故及放射醫療也給人體的正常組織造成了損傷［1］。對于電離輻照引起的細胞及機體損傷，能利用一些輻照防護劑進行預防及治療。目前，已有的抗輻射藥物雖然療效明顯，但用藥量大，且具有很強的不良反應，如惡心、嘔吐、頭痛等［15］。因此，開發療效佳、無不良作用、安全可靠的輻照防護劑迫在眉睫。

冬蟲夏草作為傳統中藥，可用于治療多種疾病［12］。已有報道顯示，CSE 可以保護137Cs 輻照小鼠的骨髓造血干細胞及小腸組織損傷，降低UV 電離輻照小鼠皮膚組織中的ROS、H2O2及DNA 損傷水平［16］；提高輻照小鼠小腸中的隱窩干細胞活力，降低小腸中凋亡細胞的數目；冬蟲夏草多糖（CS-PS）能有效地提高4 Gy60Co γ 小鼠脾臟單核細胞的活力［10，12，17］。然而，CSE 對電離輻照后睪丸組織氧化損傷是否有保護作用尚不清楚。因此，根據已有的研究，本實驗進一步研究了CSE 抗輻照作用及其機理，以期深入挖掘應用CSE 進行臨床治療的潛在價值。

生物分子損傷是輻射生物效應的物質基礎，電離輻照生物學效應的根本原因主要分為放射線與物質的相互作用導致的生物分子電離和激發的直接作用以及其產生的自由基導致的繼發作用。輻照后激發的機體電離反應會造成大量的自由基發生脂質過氧化反應，進而導致機體的氧化損傷，破壞正常生理狀態下的抗氧化防御系統的平衡，最終導致機體不能有效地對輻照損傷起到抑制作用。SOD 是抗氧化系統的第一道防線，在體內氧化與抗氧化平衡中起著重要作用，可通過歧化作用將O2-轉化成H2O2，清除O2-，降低OH-的含量，并發揮抗氧化作用保護細胞免受損傷［18］。MDA 是脂質過氧化物的分解產物，能夠與蛋白質、核酸、磷脂等含有氨基的物質進行交聯，促使了大分子化合物的分子交聯，進而導致細胞代謝異常及功能破壞［18］。因此，增強SOD 活性和降低MDA 水平可以有效清除輻射引起的自由基，并對輻射損傷起到修復和防護作用。本研究結果顯示，60Co γ 射線輻照后，小鼠睪丸組織中的MDA 水平明顯上升，SOD 活力顯著下降，反映了輻照后小鼠睪丸組織抗氧化能力的降低，而CSE 治療后，Model 組小鼠睪丸組織中的MDA 水平和SOD 活力均得到了改善性調節，由此可知，CSE可以通過睪丸組織中MDA 水平下調、SOD 活力上調來提高抗氧化能力。該結果與虎杖苷提高輻照后睪丸組織的抗氧化能力的研究結果類似。

Khan 等［19］認為，電離輻照產生較多自由基和DNA 損傷后，將可能進一步導致機體組織出現炎性浸潤、充血、增生等病變。為進一步研究CSE 對電離輻照小鼠睪丸組織的保護作用，本研究對Control組、Model 組、CSE-H 組小鼠的睪丸組織進行了HE、MPO 染色，結果顯示，Model 組小鼠睪丸組織間質結構變疏松，腔內變空，炎性細胞數目增加。CSE 治療后電離輻照小鼠睪丸組織變完整，結構緊密，炎性細胞數目減少。本實驗結果表明，CSE 保護了小鼠睪丸組織的形態結構，降低了輻照后生精細胞中的炎性細胞數目，其作用機制可能與抗氧化相關。

為進一步驗證CSE 的抗氧化功能，本研究采用了qRT-PCR 對各組小鼠的睪丸組織中的抗氧化相關的基因進行了檢測。PARP1 是一種細胞核酶，可催化聚二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）核糖基化，不僅在蛋白質的翻譯后修飾過程中發揮重要的功能，而且在修復DNA 單鏈損傷和氧化應激造成的DNA 氧化損傷等響應中占有重要的角色［20］。GSH-Px 廣泛分布于細胞質、線粒體中，具有清除生物體內自由基、阻斷脂質過氧化鏈式反應、保護細胞膜的結構及功能的作用，是一種關鍵的催化氧化酶［21］。CAT 主要是以H2O2為底物，催化相關的電子轉移，并將其分解成水、氧氣，有效地阻止其對機體有害地羥基自由基的生成，進而清除生物體內的H2O2［11,20］。研究發現，降低PARP1 和提高GSH-Px、CAT mRNA 的表達水平可以有效地抑制脂質過氧化產生的細胞損傷［9，20］。qPCR 實驗結果顯示，與Control 組相比，Model 組小鼠睪丸組織與抗氧化相關的GSH-Px、CAT 基因mRNA 相對表達量均明顯降低，PARP1 基因mRNA 相對表達量明顯上升；CSE 治療后，PARP1 基因mRNA 相對表達量明顯下降，GSH-Px 基因mRNA 相對表達量明顯上升。該結果表明，CSE 保護睪丸組織可能是通過抑制氧化損傷來起作用。但是關于CSE 對輻照小鼠睪丸組織抗氧化功能影響的具體作用成分因子，以及其作用于輻照損傷反饋信號的分子機制，仍有待進一步的研究分析。