蛻膜組織中調節性T 細胞的表達與妊娠期免疫耐受的關系

張一丹

生殖免疫學說認為妊娠的本質可視為成功的半同種移植現象，而孕婦對胚胎半同種抗原的免疫耐受情況與妊娠的成功密切相關［1］。妊娠期免疫耐受的調節涉及復雜的免疫信號網絡調節，若某一環節發生障礙均可導致妊娠失敗。大量研究發現，CD4+CD25+調節性T（Treg）細胞可通過調控機體傳統T 細胞的活化和T 細胞的免疫反應等反應過程進而主動獲得和維持自身耐受［2-3］。然而具體分子機制仍尚未完成闡明。近來研究發現，Treg 細胞/輔助性T 細胞17（Th17）的表達失衡及巨噬細胞亞群功能的改變可能與妊娠免疫耐受密切相關。但現階段，妊娠婦女孕早期Treg 細胞的功能改變是否與原因不明復發性流產（URSA）有關仍需更多證據予以證明。基于此背景，本課題擬以URSA 患者作為研究對象，通過觀察對比蛻膜組織Treg 細胞的表達情況，以深入闡明Treg 細胞的表達與妊娠期免疫耐受的關系，從而為后續更進一步的臨床研究提供新線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對深圳市人民醫院2019 年5 月至2020 年10 月收治的URSA 患者80 例作為URSA組，50 例正常早孕人工流產終止妊娠的婦女作為對照組。納入標準：（1）符合中華醫學會婦產科分會相關標準［4］；（2）對照組患者均于深圳市人民醫院行終止妊娠手術；（3）孕婦無先天性免疫性疾病；（4）孕婦及其家庭自愿參加本次實驗。排除標準：（1）2組患者均排除有染色體、內分泌異常者；（2）因外界因素導致流產者；（3）合并有感染者；（4）患者不同意簽署知情同意書者；本次研究經院倫理委員會批準。2 組患者年齡、體重指數（body indet，BMI）、孕次等基線資料差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 URSA 組與對照組妊娠婦女一般資料比較

1.2 方法 所有患者均由同一組醫師進行妊娠終止手術，并在術中收集2 組患者蛻膜組織，采用緩沖液（LP7）沖洗，除去血凝塊后進行過濾，過濾完畢后溶于IMDM 培養液制作成細胞懸液。采用免疫磁珠分離法（MACS）分離純化巨噬細胞，操作按照試劑說明書進行，試劑購置于：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；采用流式細胞術檢查Th17 和CD4+CD25+T 細胞水平，儀器購置于廣州朗日生物技術有限公司；采用酶聯免疫吸附法檢測白細胞介素-17（IL-17）、白細胞介素-23（IL-23）、白細胞介素-10（IL-10）、γ 干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-6（IL-6）、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）、轉化生長因子-β（TGF-β）、巨噬細胞移動抑制因子（MIF）水平，試劑盒購置于艾維可生物科技有限公司。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0 軟件進行數據統計。正態分布的計量資料以±s表示，采用t檢驗。分類變量采用χ2檢驗或Fisher 檢測。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蛻膜組織中Treg 細胞比例表達 URSA 組Th17 細胞和CD4+CD25-表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05），而CD4+CD25bringht、CD4+CD25bringht/CD4+表達水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中Treg 細胞比例表達（± s）

表2 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中Treg 細胞比例表達（± s）

注：URSA 為原因不明復發性流產，Th17 為輔助性T 細胞17

組別CD4+CD25bringht CD4+CD25-CD4+CD25bringht/CD4+Th17 細胞（%）URSA 組（n=80）對照組（n=50）t 值P 值0.59±0.13 9.72±1.21 5.26±1.01 7.35±0.27 5.87±0.96 10.64＜0.01 1.24±0.23 18.24＜0.01 7.02±0.81 15.23＜0.01 12.87±2.57 19.99＜0.01

2.2 蛻膜組織中巨噬細胞表面分子表達 URSA組CD36 表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05），而CD47、TSP1 表達水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中巨噬細胞表面分子表達（± s）

表3 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中巨噬細胞表面分子表達（± s）

注：URSA 為原因不明復發性流產，TSP1 為凝血酶敏感1

組別URSA 組（n=80）對照組（n=50）t 值P 值TSP1 73.54±3.54 88.51±6.55 14.86＜0.01 CD36 21.85±6.57 10.57±2.54 13.79＜0.01 CD47 96.57±10.24 99.63±5.63 2.19 0.03

2.3 Treg 細胞表達的相關性分析 Treg 細胞的表達與IL-17（r=0.54，P＜0.05）、IL-23（r=0.42，P＜0.05）、IL-10（r=-0.47，P＜0.05）、IFN-γ（r=0.51，P＜0.05）、IL-6（r=0.49，P＜0.05）均呈現相關性。見表4。

表4 Treg 細胞表達的相關性分析

2.4 蛻膜組織中相關因子表達比較 URSA 組IL-17、IL-23、IFN-γ、IL-6 表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05），IL-10 顯 著 低 于 對 照 組（P＜0.05），見表5。

表5 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中相關因子表達比較（± s）

表5 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中相關因子表達比較（± s）

注：URSA 為原因不明復發性流產，IL-17 為白細胞介素-17，IL-23 為白細胞介素-23，IL-10 為白細胞介素-10，IFN-γ 為γ 干擾素，IL-6 為白細胞介素-6

組別URSA 組（n=80）對照組（n=50）t 值P 值IL-17 47.63±4.32 19.35±2.72 45.80＜0.01 IL-23 27.01±2.61 24.32±2.15 6.38＜0.01 IL-6 37.85±5.42 19.45±3.57 23.33＜0.01 IL-10 22.02±4.03 27.67±3.97 7.85＜0.01 IFN-γ 58.24±12.21 52.18±11.67 2.83＜0.01

3 討論

URSA 病因復雜，臨床發生率約1%～5%。URSA的發生與免疫排斥密切相關。既往研究證實，T細胞在適應性免疫應答中扮演尤為重要的角色，其參與調控免疫防御、監視和介導異體移植物免疫排斥反應等多個細胞功能［6］。研究證實，母胎免疫是唯一與經典免疫學相悖的現象，即妊娠的成功與母親對胎兒維持持續的免疫耐受有關［7］。有證據表明，母親與胎兒并無直接接觸，而妊娠過程中母親接收來自于胎盤的豐富的胎盤抗原和胚胎，使母親天然的耐受型T 細胞免疫反應被激活［8］。調節性T 細胞（Treg）被發現在URSA 患者脫模組織中表達降低，故有觀點認為其表達比例失衡與URSA 發生密切相關［9］。然而母親Treg 的表達失衡及其對妊娠期免疫耐受的調控機制仍未完全闡明，故進一步開展實驗以明確其在妊娠期免疫耐受中的作用意義重大。

傳統觀點認為，Th1/Th2 的動態平衡所維持的免疫穩態是調控妊娠免疫功能的關鍵因素［10］，而隨著Th17 細胞的發現逐漸有觀點認為，Treg/Th17 共同介導的免疫調節作用可能遠遠大于Th1/Th2。重要的是研究發現，在胚胎發育的極早期便能檢測到巨噬細胞系的表達［11-12］。巨噬細胞可分為M1 和M2 亞型，其中M1 型可由IFN-γ 或脂多糖（LPS）誘導產生并介導下游炎癥因子的激活，而M2 型由IL-10和IL-4 等抗炎因子介導產生，可激發吞噬、清除凋亡細胞，低抗原提呈能力及下調協同刺激分子進而利于妊娠維持［13］。本實驗結果顯示，URSA 組婦女CD4+CD25bringht、CD4+CD25-、CD4+CD25bringht/CD4+、Th17 細胞及CD36、CD47、TSP1 水平顯著低于對照組，表明URSA 患者存在Treg 細胞、Th17 和巨噬細胞的表達紊亂。考慮母-胎免疫耐受與T 細胞功能情況密切相關，Th17/Treg 是除Th1/Th2 外相對獨立的細胞因子網絡，母-胎界面蛻膜組織中Treg 細胞表達的改變被證實是引發生殖障礙的關鍵環節［14］。動物實驗發現，小鼠Treg 細胞缺失后可顯著影響胚胎植入成功率［15］。研究發現，正常機體中Treg 細胞數量表達處于相對優勢地位，Th17 的表達被抑制，而當免疫平衡被打破后Th17 的分泌增加并繼發表達下游炎癥因子，使母-胎界面炎癥反應水平持續升高最終導致流產等不良妊娠結局發生。而巨噬細胞在免疫炎癥激活過程中亦扮演重要角色，其主要分為M1 和M2 亞型，正常機體中M1/M2 處于動態平衡狀態以維持免疫穩態正常，而免疫微環境改變后巨噬細胞更多向M1 分化，并促進下游促炎因子表達上調，進而使局部炎癥水平持續升高。研究發現，母-胎界面Treg 細胞的表達可調控巨噬細胞的活性促進其更多向M1 型細胞轉化［16］。故合理推測Treg 細胞通過調控母-胎界面Th17 細胞和巨噬細胞的活性進而參與到妊娠免疫耐受中。為進一步驗證這一猜想，本研究檢驗了各細胞相關因子的表達情況。IL-17 是Th17 的主要效應因子，可促進基質金屬蛋白酶、趨化因子和炎性細胞因子表達并繼發引起組織破壞和細胞浸潤等病理改變［17］；IL-23主要由P40 和P19 亞單位組合產生，其能參與調控CD4+T 細胞增殖并繼發引起IL-17 過表達；IL-10 是機體重要的抗炎因子，與巨噬細胞的表達類型及水平密切相關；IFN-γ 是具有廣泛免疫調節作用的淋巴因子在機體免疫調節中扮演重要角色。IL-6 是機體經典的促炎因子，可激活下游炎性因子的表達進而促進機體炎癥水平持續上升，研究發現，IL-6可通過調控CD4+T 細胞向Th17 分化進而參與免疫炎癥反應的激活，同時IL-6 可誘導CD4+T 細胞向Treg 分化并發揮免疫逃逸和免疫抑制作用［18］。結果顯示，URSA 組IL-17、IL-23、IFN-γ、IL-6 表達顯著低于對照組，且Pearson 檢驗結果顯示Treg 細胞的表達與Th17 細胞及巨噬細胞存在顯著相關性，證實妊娠期婦女蛻膜組織中Treg 細胞的表達改變可通過調節Th17 細胞及巨噬細胞活性，進而激活下游炎癥信號并影響妊娠結局。

綜上所述，妊娠期婦女脫模組織中調節性T 細胞的表達可參與Th17 細胞及巨噬細胞的分化增值，并激活下游炎癥因子的表達，進而在妊娠期免疫耐受中發揮重要作用。然而本試驗仍存不足，如樣本量過少，且僅以同期人工終止妊娠婦女作為對照，而未納入健康群體進行對比，故今后仍需進一步設置長周期大樣本試驗予以論證。