肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者血清miR-9a-5p表達水平與再出血的關系

鄧念菊，吳麗玲，葉小苗，鄺繼孫

食管胃底靜脈曲張破裂出血是肝硬化門靜脈高壓的常見并發癥之一，亦是肝硬化門靜脈高壓相關死亡的主要原因之一［1］。有研究報道稱，肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂后再出血率為30%～40%［2］。近年來隨著醫療技術的發展，肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血的治療方式也在不斷增多，如胃鏡下食管靜脈曲張套扎術、食管靜脈曲張組織膠注射術及經頸靜脈肝內門體靜脈分流術。這些治療方式雖能夠有效治療出血情況，但仍有患者治療后發生再出血［3-5］。因此，探究肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血治療后再出血的相關風險因素有著重要意義。微小核糖核酸-9a-5p（microRNA-9a-5p，miR-9a-5p）表達水平與門靜脈壓有關，其在門靜脈高壓環境下表達水平被上調，促進肝星狀細胞增殖、遷移和活化［6-7］。肝星狀細胞的持續激活是肝硬化門靜脈高壓的關鍵［8］。由此，可推測miR-9a-5p表達水平與門靜脈高壓誘發的食管胃底靜脈曲張破裂出血有關。目前，鮮有研究分析血清miR-9a-5p 表達水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的關系。本研究旨在探究肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者血清miR-9a-5p 表達水平與再出血的關系，以期為該類患者治療后再出血的預防和治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018 年2 月至2019 年3 月在海南省人民醫院就診的189 例肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者作為觀察組，觀察組患者根據是否發生再出血分為未再出血組（n=125）和再出血組（n=64）2 個亞組。另選擇同期50 例不伴食管胃底靜脈曲張的肝硬化患者作為對照組。對照組納入標準：（1）肝功能減退+門靜脈高壓證據或病理活檢確診為肝硬化；（2）經胃鏡檢查確診為無食管胃底靜脈曲張；（3）年齡、性別、肝硬化病因及Child-Pugh 分級資料等臨床資料完整。排除標準：（1）伴血液系統疾病；（2）惡性腫瘤。觀察組納入標準：（1）肝功能減退+門靜脈高壓證據或病理活檢確診為肝硬化；（2）經胃鏡檢查確診為食管胃底靜脈曲張；（3）嘔血或黑便；（4）首次食管胃底靜脈曲張破裂出血；（5）年齡、性別、肝硬化病因及Child-Pugh分級資料等臨床資料完整。排除標準：（1）有先天膽道阻塞性疾病、門靜脈高壓性胃腸病或血液系統疾病；（2）非肝硬化引發的消化道出血；（3）惡性腫瘤；（4）隨訪失聯。觀察組中男性129 例，女性60例；年齡37～70 歲［（56.69 ± 7.55）歲］；肝硬化病因：慢性乙型肝炎93 例；慢性丙型肝炎34 例；非酒精性脂肪性肝炎36 例；酒精性肝炎26 例；Child-Pugh 分級：B 級106 例，C 級83 例。對照組中男性38 例，女性12 例；年齡37～65 歲［（57.28 ± 7.27）歲］；肝硬化病因：慢性乙型肝炎26 例；慢性丙型肝炎8 例；非酒精性脂肪性肝炎9 例；酒精性肝炎7例；Child-Pugh 分級：B 級31 例，C 級19 例。2 組患者的性別構成（χ2=1.127，P=0.288）、年齡（t=0.495，P=0.621）、肝 硬 化 病 因（χ2=0.176，P=0.981）和Child-Pugh 分級構成比較差異均無統計學意義（χ2=0.566，P=0.452）。本研究符合《世界醫學大會赫爾辛基宣言》，經海南省人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 臨床信息采集 收集肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者的年齡、性別、肝硬化病因、Child-Pugh 分級、門靜脈內徑（由肝臟B 超檢查獲取）、食管靜脈曲張程度［輕度：食管靜脈略有迂曲或呈直線形，表面無紅斑、紅色條紋和血皰（紅色征）；中度：食管靜脈略有迂曲或呈直線形，有紅色征，或呈蛇形，迂曲隆起，但無紅色征；重度：食管靜脈呈蛇形，迂曲隆起，有紅色征，或呈串珠狀、結節狀或瘤狀］、紅色征、白蛋白、血小板計數、凝血酶原時間、國際標準化比值、白細胞計數、血鈉和血鈣等信息。用DxH 600 血細胞分析儀［貝克曼庫爾特實驗系統（蘇州）有限公司］檢測血小板計數；用7600 型全自動生化分析儀（日本日立公司）檢測血鈉、血鈣和白蛋白水平；用c3100 全自動血凝儀（邁瑞公司）檢測凝血酶原時間和國際標準化比值。

1.3 血清miR-9a-5p 表達水平檢測 用實時熒光定量PCR 法檢測血清miR-9a-5p 表達水平［9］。抽取對照組和觀察組患者治療前、后（鏡下治療24 h 后）肘部靜脈血10 ml，離心后提取血清，將其凍存在-80 ℃冰箱中待測。取凍存的血清，解凍后用RNA 提取試劑盒（日本Takara 公司）提取血清中總RNA；用752 型紫外分光光度計（上海光學儀器五廠有限公司）檢測RNA 純度，吸光度比值（OD260/280）為1.9～2.0；用反轉錄試劑盒（日本Takara 公司）將RNA 反轉錄為cDNA；用9700 型PCR 儀（美國ABI 公司）擴增產物，反應條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40 個循環。miR-9a-5p 上游序列：5'-GCGGCGGTCTTTTGGTTATCTAG - 3' ，下 游 序 列：5' - ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；內參U6 上游序列：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'，下游序列：5'-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔct計算血清miR-9a-5p 相對表達水平。

1.4 預后隨訪 采用電話或復診方式隨訪肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者，每1 個月電話隨訪1 次，每3 個月復診1 次，末次隨訪時間為2021年3 月10 日，本研究將至隨訪結束或隨訪過程中發生再出血及因再出血誘發的死亡定義為預后不良。

1.5 統計學處理 采用SPSS 23.0 軟件包進行數據統計分析。正態分布的計量資料用±s表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；2 組治療前后的miR-9a-5p 表達水平比較采用重復測量方差分析。計數資料用百分比（%）表示，2 組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評價血清miR-9a-5p 表達水平預判再出血的價值。用Logistic 回歸分析血清miR-9a-5p 表達水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血預后的關系。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和對照組患者血清miR-9a-5p 表達水平比較 觀察組患者治療前、后血清miR-9a-5p 表達水平分別為1.87 ± 0.29 和1.58 ± 0.24，均高于對照組的1.08 ± 0.15，差異均有統計學意義（t=26.407、18.200，均P＜0.001）。

2.2 未再出血組和再出血組患者血清miR-9a-5p表達水平比較 未再出血組和再出血組患者血清miR-9a-5p 相對表達水平差異有統計學意義（F=33.974，P＜0.001），未再出血組患者治療前血清miR-9a-5p 相對表達水平低于再出血組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療前和治療后的患者血清miR-9a-5p 相對表達水平差異有統計學意義（F=184.973，P＜0.001），未再出血組和再出血組患者治療后血清miR-9a-5p 相對表達水平均低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05）；再出血和時間有交互效應（F=51.963，P＜0.001），未再出血組患者治療后血清miR-9a-5p 相對表達水平降低程度低于再出血組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 未再出血組和再出血組患者血清miR-9a-5p表達水平比較（± s）

表1 未再出血組和再出血組患者血清miR-9a-5p表達水平比較（± s）

組別未再出血組再出血組t/Z 值P 值例數125 64治療前1.76±0.25 2.10±0.21 9.265＜0.001治療后1.59±0.23 1.55±0.26 1.069 0.287變化值0.25（0.11，0.45）0.56（0.33，0.72）5.364＜0.001

2.3 血清miR-9a-5p 表達水平判斷再出血的價值 治療前患者血清miR-9a-5p 表達水平判斷再出血的ROC 曲線下面積高于治療后，差異有統計學意義（Z=5.393，P＜0.001）。見表2 和圖1。

圖1 血清miR-9a-5p 表達水平預判再出血的ROC 曲線

表2 血清miR-9a-5p 表達水平預判再出血的價值

2.4 未再出血組和再出血組患者的臨床特征比較 2 組患者的年齡、性別構成、肝硬化病因構成、血小板計數、凝血酶原時間和國際標準化比值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。再出血組患者的白蛋白、血鈉和血鈣水平均低于未再出血組，而Child-Pugh C 級占比、門靜脈內徑、重度食管靜脈曲張占比和紅色征占比高于未再出血組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 未再出血組和再出血組患者的臨床特征比較

2.5 肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者預后的Logistic 回歸分析 將肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者治療后是否發生再出血作為因變量，將白蛋白、血鈉、血鈣、Child-Pugh 分級、門靜脈內徑、食管靜脈曲張程度、紅色征和治療前miR-9a-5p表達水平作為自變量納入多因素Logistic 回歸分析，上述自變量均以各自的中位數為界轉換為二分類變量，賦值見表4，結果顯示，Child-Pugh C 級、門靜脈內徑＞1.30 cm、重度食管靜脈曲張、紅色征和治療前miR-9a-5p 表達水平＞1.89 是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的獨立危險因素（P＜0.05），而血鈉＞136.67 mmol/L 是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的獨立保護因素（P＜0.05）。見表5。

表4 賦值情況

表5 肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血預后的Logistic 回歸分析

3 討論

再出血是評價肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血治療后患者預后的重要指標［10］。探究肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血治療后再出血的相關風險因素是近年來研究的熱點。本研究將再出血作為預后評價指標，主要分析血清miR-9a-5p 表達水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血治療后再出血的關系。

本研究結果顯示，觀察組患者治療前、后血清miR-9a-5p 表達水平均高于對照組，提示miR-9a-5p表達水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張有關，參與了發病和進展過程。此外，未再出血組和再出血組患者治療后的血清miR-9a-5p 相對表達水平均低于治療前，未再出血組患者治療前血清miR-9a-5p 相對表達水平低于再出血組，提示血清miR-9a-5p 表達水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血治療后再出血有關，探究二者之間的關系，或可對肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血治療后再出血的預防和治療提供幫助。本研究構建了治療前和治療后血清miR-9a-5p 表達水平判斷肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的ROC 曲線，結果顯示治療前血清miR-9a-5p 表達水平判斷再出血的ROC 曲線下面積為0.839，高于治療后的0.554，提示治療前血清miR-9a-5p 表達水平判斷再出血的價值較高，可輔助臨床決策。

門靜脈高壓環境下，miR-9a-5p 表達水平被上調，其可促進肝星狀細胞活化、增殖和遷移；干擾miR-9a-5p 表達水平，可顯著抑制肝星狀細胞活化、增殖和遷移［6-7］。肝星狀細胞與肝臟微循環環境密切相關，其在肝細胞功能、血管張力調節和炎癥控制方面均發揮著重要作用［11-13］。本研究中Logistic回歸分析結果顯示，治療前miR-9a-5p 相對表達水平＞1.89 是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的獨立危險因素，推測原因可能是miR-9a-5p表達水平與患者肝星狀細胞的活化、增殖和遷移密切相關，其可通過誘導肝星狀細胞的活化、增殖和遷移促進肝纖維化，增加門靜脈壓；此外，在門靜脈高壓環境下，miR-9a-5p 表達水平上調，促進肝星狀細胞活化、增殖和遷移，加重肝纖維化進展，進一步促進門靜脈壓升高。miR-9a-5p 可能通過上述機制調節門靜脈壓，其表達量可反映肝硬化患者門靜脈壓高低。門靜脈壓升高是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血的重要誘因。因此，血清miR-9a-5p 表達水平可反映肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血情況。

既往研究［14-17］已證實Child-Pugh C 級、寬門靜脈內徑、重度食管靜脈曲張、紅色征和低血鈉與肝硬化食管胃底靜脈曲張患者發生再出血有關。本研究結果顯示，Child-Pugh C 級、門靜脈內徑＞1.30 cm、重度食管靜脈曲張和紅色征是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的獨立危險因素，而血鈉＞136.67 mmol/L 是肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的獨立保護因素，與上述文獻結果一致。既往研究［18-19］報道了白蛋白和血鈣水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血有關，本研究結果顯示再出血組的白蛋白和血鈣水平均低于未再出血組，提示二者與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血有關。但本研究中Logistic 回歸分析結果顯示，白蛋白和血鈣水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血無關，推測該差異可能與樣本量大小有關，后續還需增加樣本量進一步分析二者與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的關系。

本研究尚存在一定不足，僅分析了治療前和治療后血清miR-9a-5p 表達水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血治療后再出血的關系，對于其他時點的血清miR-9a-5p 表達水平對肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血的預示作用還未闡明；此外，本研究樣本量有限，分析結果可能有一定偶然性，后續將針對以上不足進行進一步研究。

綜上所述，治療前患者血清miR-9a-5p 表達水平與肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血后再出血有關。對于治療前血清miR-9a-5p 表達水平高的肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者，應加以重視，避免不良事件發生。