黃花蒿酵解液聯(lián)合多西他賽對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/DTX 逆轉(zhuǎn)作用的研究

李燕，寇曉梅，柯永莉

乳腺癌作為女性多發(fā)的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，由于發(fā)病因素目前無(wú)確定的機(jī)制且受到多種因素的影響，環(huán)境因素引起相關(guān)基因發(fā)生突變，飲食習(xí)慣與飲食結(jié)構(gòu)的改變和體內(nèi)性激素水平異常升高都會(huì)引起乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高。目前乳腺癌主要的治療手段為放療、化療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療［1］。化療藥物通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用，有效控制疾病進(jìn)程，能夠有效地改善患者的生活質(zhì)量，有效增長(zhǎng)患者的生存年限。但同時(shí)也會(huì)引起調(diào)控基因表達(dá)的失控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐受產(chǎn)生多藥耐藥性［2］。多西他賽（docetaxel，DTX）通過(guò)與β-微管蛋白結(jié)合發(fā)揮作用，阻滯腫瘤細(xì)胞有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3］。黃花蒿（Artemisia annua L）的主要成分青蒿素（Artemisinin）具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，并且具有對(duì)抗多藥耐藥的能力。為尋找具有臨床應(yīng)用價(jià)值的逆轉(zhuǎn)劑，本研究探究了黃花蒿酵解液聯(lián)合多西他賽對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DTX 的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科細(xì)胞室提供，人乳腺癌多西他賽耐藥細(xì)胞株MCF-7/DTX由實(shí)驗(yàn)室低濃度梯度誘導(dǎo)培養(yǎng)，傳代2～3 周后，細(xì)胞呈指數(shù)生長(zhǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料儀器與設(shè)備

高糖型（DMEM-H）細(xì)胞培養(yǎng)基：DME H-21、4.5 g/L 葡萄糖、10%新生牛血清，新生牛血清，胰蛋白酶，多西他賽RPM I-1640 培養(yǎng)液，0.2 μm 過(guò)濾膜，黃花蒿酵解液由實(shí)驗(yàn)室制備，四甲基偶氮唑藍(lán)，二甲亞砜，人多藥耐藥蛋白（multi-drug resistance protein1，MDR1）Elisa 試劑盒，多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multi-drug resistance-associated protein1，MRP1）Elisa 試劑盒，乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）Elisa 試劑盒，肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-related protein，LRP）Elisa 試劑盒。

1.3 儀器

恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，熒光分析酶標(biāo)儀。

2 方法

2.1 黃花蒿酵解液的制備

2.1.1 準(zhǔn)備 將浸泡后的糯米蒸熟，倒入冷水使溫度降至28～30 ℃，后將其放入缸里，將酒藥一并倒入到缸里，搓散糯米，搭醅挖凹，底面直徑約15 cm，米上再薄撒一層酒藥，經(jīng)24～30 h 后釀液浸出，缸內(nèi)溫度降至室溫24 h 后，釀塊浮起，按比例加入冷水、切塊及翻轉(zhuǎn)［4］。

2.1.2 初步發(fā)酵 48 h 后倒入蒸熟米，黃花蒿葉末，加曲拌勻，進(jìn)行發(fā)酵。過(guò)12～18 h 后排除二氧化碳（CO2），72 h 后重復(fù)上述步驟拌缸

2.1.3 慢發(fā)酵 96 h 后，灌入小埕，液面距口10 cm，扎好埕口，在低溫、低氧環(huán)境下保存。

2.1.4 制備 90 d 后取上清液，離心30 min（3 000 r/min，r=8 cm），0.2 μum 過(guò)濾膜過(guò)濾，得酵解液。

2.1.5 配制工作液 將細(xì)胞酵解液分別稀釋成10 g/L，20 g/L，30 g/L，40 g/L。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

2.2.1 接種 將MCF-7 細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)基于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2.2.2 換液 2～3 d 后當(dāng)培養(yǎng)基顏色變化，將其置于無(wú)菌操作臺(tái)，打開(kāi)瓶口，將其中的培養(yǎng)液去掉，再往其中加入5～6 ml 新鮮培養(yǎng)基，然后再放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.3 傳代培養(yǎng) 當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)80%左右清洗，棄去上清液，將0.25% 胰蛋白酶37 ℃預(yù)熱后加入，3～5 min 后吸去胰酶，用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之完全脫落，然后吸取加入到新的培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代。

2.3 配制DTX 細(xì)胞液

用RPM I-1640 培養(yǎng)液稀釋多西他賽注射液，至濃度為0.5 μg/L，準(zhǔn)備使用。

2.4 建立耐藥株MCF-7/DTX 模型

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的約1×107個(gè)MCF-7 細(xì)胞，將0.5 μg/L DTX分別稀釋至0.01 μg/L，0.02 μg/L，0.05 μg/L，0.1 μg/L，0.2 μg/L，首先用0.01 μg/L DTX 細(xì)胞液培養(yǎng)MCF-7 細(xì)胞，72 h后棄去培養(yǎng)基的上清液洗凈，繼續(xù)用0.02 μg/L DTX 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞，重復(fù)以上步驟進(jìn)行濃度逐步到0.5 μg/L，進(jìn)行遞增性誘導(dǎo)［5］，最終維持培養(yǎng)在0.5 μg/LDTX 細(xì)胞液中。

2.5 測(cè)定不同濃度黃花蒿酵解液作用后DTX 對(duì)MCF-7/DTX 細(xì)胞的增殖抑制率

取1×105/ml MCF-7/DTX 細(xì)胞懸液，接種96 孔板，每孔100 μl，按照加入不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX 分組，A 組為對(duì)照組，不加藥物。B 組加入10 g/L 黃花蒿酵解液，C 組加入20 g/L 黃花蒿酵解液，D 組加入30 g/L 黃花蒿酵解液，E 組加入40 g/L 黃花蒿酵解液。置37 ℃、5%CO2及飽和濕度的條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。待其貼壁后，每組分別加入DTX 使其終濃度1、2、3、4 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL。對(duì)照組不加DTX，加入等量的DMEM 培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后，每孔中加入5 mg/ml 的噻唑藍(lán)（MTT）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心去上清液，每孔加入DMSO 150 μl 溶解結(jié)晶顆粒。用酶標(biāo)儀于490 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（A），計(jì)算不同濃度的DTX 對(duì)MCF-7/DTX 細(xì)胞的增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。增值抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組平均吸光值/對(duì)照組平均吸光值）×100%［6］。

2.6 測(cè)定黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX 細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)的影響

采用綜合計(jì)算法，計(jì)算出半數(shù)抑制率的DTX 濃度（IC50）。細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)=對(duì)照組細(xì)胞IC50/實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞IC50。

2.7 MDR1 Elisa 試劑盒檢測(cè)MRP1 水平

取ABCDE 細(xì)胞上清液稀釋，在孔底先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl 加樣將樣品加于孔底部，輕輕晃動(dòng)混勻，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外。再次溫育洗滌，每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。再加入終止液50 μl 終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)量各孔的吸光度（OD 值），每個(gè)待測(cè)樣品，陽(yáng)性液，陰性液設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，空白孔1 個(gè)。

2.8 MRP1 Elisa 試劑盒檢測(cè)MRP1 水平

在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50 μl，在其他孔中加入抗體稀釋液40 μl，取ABCDE 5 組的隔夜培養(yǎng)細(xì)胞樣品上清液10 μl，加于酶標(biāo)板孔底部，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min，將20 倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600 ml后備用，揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外。每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加50 μl終止液終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在450 nm的吸光度（OD 值）。每個(gè)待測(cè)樣品，陽(yáng)性液，陰性液設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，空白孔1 個(gè)。

2.9 BCRP Elisa 試劑盒檢測(cè)BCRP 水平

每板設(shè)陰性對(duì)照3 孔、陽(yáng)性對(duì)照3 孔、空白對(duì)照1 孔，空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，用緩沖液將抗體稀釋至1～10 μg/ml。在反應(yīng)孔中加0.1 ml 抗體，4 ℃下過(guò)夜，次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3 次，加一定稀釋的6 組樣品，陰性試劑，陽(yáng)性試劑0.05 ml 于上述已包被的反應(yīng)孔中，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，置37 ℃孵育1 h 洗滌，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.05 ml。37 ℃孵育0.5～1 h，洗滌，于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB 底物溶液0.1 ml，置于37 ℃下10～30 min 后，在各反應(yīng)孔中加入2M 硫酸0.05 ml 終止反應(yīng)，在ELISA 檢測(cè)儀上，于450 nm 以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD 值。

2.10 LRP Elisa 試劑盒檢測(cè)LRP 水平

用標(biāo)本稀釋液1:1 稀釋后加入50 μl 于反應(yīng)孔內(nèi)，再加入ABCDE 5 組樣品50 μl，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，加入后立即加入50 μl 的生物素標(biāo)記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3 次，每孔加入80 μl 的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3 次，每孔加入底物A、B各50 μl，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育10 min。避免光照，取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μl 終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD 值，每個(gè)待測(cè)樣品，陽(yáng)性液，陰性液設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，空白孔1 個(gè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，計(jì)量單位采用±s表示，組間兩兩差異比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)，組間差異采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)單位用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX 細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)

不同濃度的黃花蒿酵解液可以增強(qiáng)細(xì)胞逆轉(zhuǎn)作用，減少M(fèi)CF-7/DTX 的耐藥程度，黃花蒿酵解液濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率越高，逆轉(zhuǎn)作用越明顯（P＜0.05），見(jiàn)表1。隨著黃花蒿酵解液的濃度升高，半數(shù)抑制濃度逐漸降低，逆轉(zhuǎn)指數(shù)逐漸升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 不同濃度黃花蒿酵解液作用后DTX 對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞增殖抑制率的影響（%，± s）

表1 不同濃度黃花蒿酵解液作用后DTX 對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞增殖抑制率的影響（%，± s）

注：DTX 為多西他賽

組別無(wú)DTX A 組（對(duì)照組）B 組（MCF-7/DTX+10 g/L 黃花蒿酵解液）C 組（MCF-7/DTX+20 g/L 黃花蒿酵解液）D 組（MCF-7/DTX+30 g/L 黃花蒿酵解液）E 組（MCF-7/DTX+40 g/L 黃花蒿酵解液）P 值0.23±0.01 11.37±0.02 DTX 濃度1 μg/ml 12.40±0.02 13.43±0.23 DTX 濃度2 μg/ml 14.67±0.21 17.56±0.11 DTX 濃度3 μg/ml 19.38±0.05 26.77±0.13 DTX 濃度4 μg/ml 24.78±0.02 30.65±0.03 43.57±0.11 53.32±0.14 56.63±0.23 60.34±0.11 64.65±0.07 74.22±0.04 78.64±0.15 80.45±0.13 88.39±0.21 90.49±0.03 82.53±0.11 87.43±0.05 89.34±0.07 91.85±0.14 93.28±0.11＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表2 不同濃度黃花蒿酵解液作用對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的影響（± s）

表2 不同濃度黃花蒿酵解液作用對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的影響（± s）

注：DTX 為多西他賽

組別A 組（對(duì)照組）B 組（MCF-7/DTX+10 g/L 黃花蒿酵解液）C 組（MCF-7/DTX+20 g/L 黃花蒿酵解液）D 組（MCF-7/DTX+30 g/L 黃花蒿酵解液）E 組（MCF-7/DTX+40 g/L 黃花蒿酵解液）P 值IC50 0.92±0.01 0.84±0.03 0.65±0.03 0.46±0.02 0.33±0.01 0.009逆轉(zhuǎn)指數(shù)1.11 1.37 1.88 2.79

4.2 黃花蒿酵解液對(duì)MDR1 水平的影響

經(jīng)不同濃度的黃花蒿酵解液處理后，MCF-7/DTX 細(xì)胞的MDR1 水平顯著低于對(duì)照組。黃花蒿酵解液濃度越高，MDR1 的水平越低，對(duì)MDR1 的抑制程度越高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞MDR1 水平的影響（± s）

表3 不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞MDR1 水平的影響（± s）

注：DTX 為多西他賽，MRP1 為多藥耐藥相關(guān)蛋白，OD 為吸光度

組別陰性組A 組（對(duì)照組）B 組（MCF-7/DTX+10 g/L 黃花蒿酵解液）C 組（MCF-7/DTX+20 g/L 黃花蒿酵解液）D 組（MCF-7/DTX+30 g/L 黃花蒿酵解液）E 組（MCF-7/DTX+40 g/L 黃花蒿酵解液）陽(yáng)性組OD（MRP1）0.14±0.02 2.78±0.12 1.87±0.07 1.42±0.01 0.72±0.04 0.24±0.02 0.72±0.06 P 值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

4.3 黃花蒿酵解液對(duì)MRP1 水平的影響

經(jīng)不同濃度的黃花蒿酵解液處理后，MCF-7/DTX 細(xì)胞的MRP1 水平顯著低于對(duì)照組。黃花蒿酵解液濃度越高，MRP1 的水平越低，對(duì)MRP1 的抑制程度越高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞MRP1 水平的影響（± s）

表4 不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞MRP1 水平的影響（± s）

注：DTX 為多西他賽，MRP1 為多藥耐藥相關(guān)蛋白，OD 為吸光度

組別陰性組A 組（對(duì)照組）B 組（MCF-7/DTX+10 g/L 黃花蒿酵解液）C 組（MCF-7/DTX+20 g/L 黃花蒿酵解液）D 組（MCF-7/DTX+30 g/L 黃花蒿酵解液）E 組（MCF-7/DTX+40 g/L 黃花蒿酵解液）陽(yáng)性組OD（MRP1）0.12±0.01 2.33±0.21 1.92±0.03 1.25±0.16 0.55±0.10 0.24±0.02 0.80±0.01 P 值0.002＜0.01＜0.01＜0.01

4.4 黃花蒿酵解液對(duì)BCRP 水平的影響

經(jīng)不同濃度的黃花蒿酵解液處理后，MCF-7/DTX 細(xì)胞的BCRP 水平顯著低于對(duì)照組。黃花蒿酵解液濃度越高，MRP1 的水平越低，對(duì)BCRP 的抑制程度越高（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞BCRP 水平的影響（± s）

表5 不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞BCRP 水平的影響（± s）

注：DTX 為多西他賽，BCRP 為乳腺癌耐藥蛋白，OD 為吸光度

組別陰性組A 組（對(duì)照組）B 組（MCF-7/DTX+10 g/L 黃花蒿酵解液）C 組（MCF-7/DTX+20 g/L 黃花蒿酵解液）D 組（MCF-7/DTX+30 g/L 黃花蒿酵解液）E 組（MCF-7/DTX+40 g/L 黃花蒿酵解液）陽(yáng)性組OD（BCRP）0.19±0.02 2.40±0.07 1.67±0.04 1.36±0.12 0.52±0.08 0.24±0.03 0.76±0.02 P 值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

4.5 黃花蒿酵解液對(duì)LRP 水平的影響

經(jīng)不同濃度的黃花蒿酵解液處理后，MCF-7/DTX 細(xì)胞的LRP 水平顯著低于對(duì)照組。黃花蒿酵解液濃度越高，LRP的水平越低，對(duì)LRP 的抑制程度越高（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞LRP 水平的影響（± s）

表6 不同濃度黃花蒿酵解液對(duì)MCF-7/DTX細(xì)胞LRP 水平的影響（± s）

注：DTX 為多西他賽，LRP 為肺耐藥蛋白，OD 為吸光度

組別陰性組A 組（對(duì)照組）B 組（MCF-7/DTX+10 g/L 黃花蒿酵解液）C 組（MCF-7/DTX+20 g/L 黃花蒿酵解液）D 組（MCF-7/DTX+30 g/L 黃花蒿酵解液）E 組（MCF-7/DTX+40 g/L 黃花蒿酵解液）陽(yáng)性組OD（LRP）0.15±0.02 2.67±0.11 1.75±0.02 1.52±0.01 0.69±0.03 0.27±0.01 0.75±0.02 P 值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

5 討論

2020 年，全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226 萬(wàn)例，超過(guò)了肺癌的220 萬(wàn)例，乳腺癌取代肺癌，成為全球第一大癌［7］。乳腺癌是一種由多種因素引起的惡性腫瘤，首要因素是由于家族遺傳引起的惡性腫瘤。近年女性進(jìn)行人工流產(chǎn)的人數(shù)增多，女性在終止妊娠時(shí)乳腺組織容易受到致癌物的影響。同時(shí)口服避孕藥成為常見(jiàn)的避孕方式，使乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。伴隨人們生活水平提高而來(lái)的是飲食營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的改變，高脂肪高熱量的飲食習(xí)慣，超重或者肥胖都會(huì)引起乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高［8］。

隨乳腺癌診療水平的提高與治療方法的多樣化，5 年生存率已高達(dá)90%［1］，化學(xué)藥物治療中多西他賽與其他藥物相比有其優(yōu)越性，一是人體內(nèi)代謝多西他賽需要較長(zhǎng)時(shí)間，達(dá)峰濃度高，故多西他賽經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝降低至無(wú)效濃度的歷經(jīng)時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)揮作用時(shí)間長(zhǎng)［9］。二是服用多西他賽后出現(xiàn)過(guò)敏等不良反應(yīng)的幾率低，安全性較高［10］。多西他賽通過(guò)加強(qiáng)微管蛋白聚合，抑制微管蛋白的解聚發(fā)揮作用，細(xì)胞的有絲分裂需要微管聚合和解聚的正常動(dòng)態(tài)平衡，故微管解聚產(chǎn)生的拉力無(wú)法產(chǎn)生，染色體無(wú)法向兩極移動(dòng)，從而抑制了癌細(xì)胞分裂和增殖［11］。但多西他賽在長(zhǎng)期用藥后會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥性，目前耐藥機(jī)制的產(chǎn)生與通透性糖蛋白（P-gp）高表達(dá)有關(guān)，P-gp 是一種跨膜蛋白，能夠?qū)⑽者M(jìn)細(xì)胞內(nèi)的多種化療藥物出體外，從而產(chǎn)生多藥耐藥性，與P-gp 功能相同的是，BCRP 和MRP 均屬于藥物排出泵，可以將吸收的各種化療藥物泵出體外，產(chǎn)生細(xì)胞多藥耐藥［12］。細(xì)胞外排藥物的機(jī)制不僅通過(guò)細(xì)胞膜上的藥泵，還可以通過(guò)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，這種通過(guò)胞吐機(jī)制外排藥物受LRP 基因的調(diào)控，LRP 也是眾多與多藥耐藥相關(guān)基因的一種，多西他賽使用后也會(huì)表現(xiàn)LRP 高水平表達(dá)，據(jù)相關(guān)研究，LRP 表達(dá)的蛋白LRP 表達(dá)的蛋白先使進(jìn)入核孔的藥物進(jìn)入胞質(zhì)，繼續(xù)使藥物進(jìn)入囊泡從而排到細(xì)胞外［13］。多藥耐藥的發(fā)生使得藥物失去藥效，乳腺癌患者的生存率降低，臨床為增加患者的生存時(shí)間積極尋找耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)劑，增加藥物的療效，提高患者生存率。

腫瘤化療藥物誘導(dǎo)的多藥耐藥通過(guò)多種信號(hào)通路產(chǎn)生，目前發(fā)現(xiàn)的許多逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的藥物長(zhǎng)期使用后，毒副作用大或者抑制效率很低，在臨床上很難推廣，因?yàn)槲魉幠孓D(zhuǎn)劑往往只能針對(duì)其中的一種耐藥機(jī)制進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，因此逆轉(zhuǎn)效率不高。黃花蒿中富含青蒿素［14］，青蒿素對(duì)正常細(xì)胞的殺傷力很小，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力強(qiáng)，并且青蒿素是中藥，與抗腫瘤的西藥不存在相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)西藥協(xié)同作用，增強(qiáng)藥物的抗腫瘤作用。另一方面青蒿素能夠抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性，腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶水平與細(xì)胞的敏感性成正相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性降低后MDR1、MRP1，BCRP 和LRP 高表達(dá)發(fā)生逆轉(zhuǎn)［15］，青花蒿酵解液中的成分多樣，同時(shí)抑制體內(nèi)多種信號(hào)通路靶點(diǎn)。故青花蒿酵解液不僅低毒，而且作用高效，具有廣闊前景。

本研究顯示，經(jīng)過(guò)不同濃度的黃花蒿酵解液處理后，細(xì)胞增殖抑制率得到升高，多西他賽對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用得到增強(qiáng)，黃花蒿酵解液與多西他賽聯(lián)合，相互協(xié)同發(fā)揮作用，黃花蒿酵解液可以增強(qiáng)細(xì)胞逆轉(zhuǎn)作用，減少M(fèi)CF-7/DTX 的耐藥程度，黃花蒿酵解液濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率越高，逆轉(zhuǎn)作用越明顯隨著黃花蒿酵解液的濃度升高，半數(shù)抑制濃度逐漸降低，逆轉(zhuǎn)指數(shù)逐漸升高。黃花蒿在抗多藥耐藥也具有其強(qiáng)效的作用，經(jīng)過(guò)不同濃度的黃花蒿酵解液處理后，MCF-7/DTX 細(xì)胞的MDR1，BCRP，LRP 的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。黃花蒿酵解液的濃度越高，MDR1，BCRP，LRP 的水平越低，對(duì)MDR1，BCRP，LRP 的抑制程度越高。

綜上所述，花蒿酵解液聯(lián)合多西他賽可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DTX 對(duì)多西他賽的耐藥性，增強(qiáng)MCF-7/DTX 對(duì)多西他賽的敏感性。