ASB16 反義RNA1 在鼻咽癌組織中的表達及對鼻咽癌細胞增殖、凋亡的影響和作用機制

李穎，李玉杰，于敏

鄭州大學附屬鄭州中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科一病區，鄭州4500000

鼻咽癌是一種起源于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤，其在中國尤其是南方地區具有較高的發病率和病死率[1]。鼻咽癌發病隱匿且病情進展迅速，易發生淋巴結轉移和遠處轉移[2]。目前，鼻咽癌患者尤其是晚期患者的治療效果不佳，多數患者易出現放療抵抗和局部復發[3]。因此，尋找新的治療靶點對于改善鼻咽癌患者預后十分重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是兩類與人類腫瘤發生發展密切相關的非編碼RNA，lncRNA 能夠作為競爭性內源性RNA 結合miRNA，還可以控制miRNA 靶基因的表達，調控其下游信號通路，從而影響腫瘤的發展[4-7]。ASB16 反義RNA1（ASB16 antisense RNA 1，ASB16-AS1）是一種lncRNA，與多種腫瘤的發生有關。Fu 等[8]研究顯示，胃癌組織中ASB16-AS1 表達上調，其通過競爭性結合miRNA-3918 和miRNA-4676-3p 促進E3 泛素化連接酶TRIM37 的表達，增強胃癌細胞的增殖能力和干細胞特性，在胃癌中發揮致癌基因的作用。Tan 等[9]研究顯示，ASB16-AS1 在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織和細胞系中表達上調，干擾其表達可通過阻斷WNT/β-連環素（β-catenin）信號通路減弱NSCLC 細胞的增殖和菌落形成，并使G0/G1期細胞周期停滯，加速細胞凋亡。但目前關于ASB16-AS1 在鼻咽癌組織中的表達及其作用機制尚不清楚。在線軟件預測顯示，ASB16-AS1可能與miRNA-363-5p具有靶向調控關系。本研究探討ASB16-AS1 在鼻咽癌組織中的表達及對鼻咽癌細胞C666-1 增殖和凋亡的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年5 月至2020 年12 月于鄭州大學附屬鄭州中心醫院經病理檢查確診為鼻咽癌且具有完整病理資料的患者。納入標準：經病理檢查確診為鼻咽癌；未接受放化療；未合并其他惡性腫瘤；依從性好。排除標準：合并自身免疫性疾病；合并肝、腎等器質性病變。依據納入和排除標準，本研究共納入33 例患者。取患者的鼻咽癌組織和對應的癌旁組織，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 細胞和試劑

胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，鼻咽癌細胞系C666-1 購自中國科學院上海細胞庫，RPMI1640 培養基、CCK8 試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購自深圳晶美生物工程有限公司，兔抗人Ki-67、cleaved caspase 3、pro-caspase 3、磷酸甘油醛脫氫酶（phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司，LipofectamineTM2000 試 劑盒、Trizol 試 劑 均購 自美 國Invitrogen 公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒、凋亡試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；PCR 引物、ASB16-AS1的小干擾RNA（si-ASB16-AS1）、miRNA-363-5p 模擬物（mimcs）與各自的對照序列anti-miRNA-NC、si-NC、miRNA-363-5p 抑制劑（anti-miRNA-363-5p）、miRNA-NC 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測ASB16-AS1 和miRNA-363-5p 表達 應用Trizol提取組織中的總RNA，反轉錄為cDNA，反轉錄體系：5×DNA loading buffer 2 μl，10×King RT buffer 2 μl，FastKing RT 酶1 μl，FQ-RT 引物2 μl，RNA 2 μg，無RNase ddH2O 補足體系至20 μl；反應條件：42 ℃15 min，95 ℃3 min。反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR 擴增，反應體系：10×PCR buffer 2.5 μl，MgSO42.5 μl，dNTP 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，無RNase ddH2O 補足體系至25 μl；反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性60 s，60 ℃退 火30 s，72 ℃延 伸30 s，共40 個 循 環。ASB16- AS1 上游引物5'- CTCATGTAGCCTGGACCTCC- 3'，下 游 引 物5'- TCACACCTGTAATCCCAGCA-3'；miRNA-363-5p 上 游引 物5'-GTGTCCCGTAAGCTGATC-3'，下游引物5'-CACGGTCACGTTGTCACAAG-3'；GAPDH上游引物5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，下游引物5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG- 3'；U6上 游 引 物5'-GAGCCAAGGAATCAACCTTTGAAG-3'，下 游 引物5'-GATCGTAGTCCAGGAGCAACTGAG-3'。以GAPDH、U6為內參，采用2-△△Ct法計算ASB16-AS1、miRNA-363-5p 的相對表達量。

1.3.2 細胞培養和分組轉染 以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基培養C666-1 細胞。于6 孔板中接種對數期C666-1 細胞，采用LipofectamineTM2000 脂質體，將si-ASB16-AS1（si-ASB16-AS1 組）、si-NC（si-NC 組）、si-ASB16-AS1+anti-miRNA-363-5p（si-ASB16-AS1+anti-miRNA-363-5p 組）、si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC（si-ASB16-AS1+antimiRNA-NC 組）轉染至C666-1 細胞，并培養24 h。

1.3.3 CCK8 法檢測細胞增殖 于96 孔板中接種各組細胞，培養24、48、72 h，加入CCK8 試劑10 μl孵育2 h，酶標儀測定光密度（optical density，OD）值，檢測波長為450 nm。

1.3.4 克隆形成實驗 各組細胞接種于6 孔板中（500/孔），置于培養箱中繼續培養直至出現肉眼可見的細胞克隆團，隨后棄培養基，并加入預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，按照每孔500 μl 的密度將甲醇加入其中，-20 ℃固定20 min，棄甲醇后按照每孔400 μl的密度將1%結晶紫染色液加入其中，室溫下染色15 min，采用蒸餾水洗滌后晾干，拍照并觀察細胞克隆形成數。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 各組細胞培養48 h 后，收集細胞。加入預冷的PBS 洗滌后棄上清，將500 μl binding buffer 加入細胞沉淀中重懸細胞，分別將5 μl膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）與5 μl 碘化丙啶（propidium iodide，PI）加入懸浮細胞中，充分混勻后室溫避光孵育10 min，應用FACS Calibur 流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度，然后加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）上樣緩沖液，將其置于沸水中煮10 min 使蛋白變性，按照每孔20 μg 蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后室溫封閉2 h，加入Ki-67（1∶1000）、cleaved caspase 3（1∶800）和pro-caspase 3（1∶800），置于4 ℃冰箱內孵育24 h，使用TBST 洗滌后加入山羊抗兔二抗（1∶3000），室溫條件下孵育1 h，滴加電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）工作液，于暗室下曝光顯影、定影，采用Quantity One 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗 應用PCR 法擴增含miRNA-363-5p 結合位點的ASB16-AS1 的3'-非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）序列，并利用基因突變技術將結合位點突變，插入熒光素酶報告基因質粒pGL3-promoter，構建ASB16-AS1野生型質粒（WT-ASB16-AS1）和ASB16-AS1 突變型質粒（MUT-ASB16-AS1）。分別將WT-ASB16-AS1、MUT-ASB16-AS1 與miRNA-363-5p mimic 或miRNA-NC 共轉染至C666-1 細胞，培養1 天后，檢測熒光素酶活性。

1.4 統計學分析

采用GraphPad Prism 7.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；采用Pearson 相關分析法分析鼻咽癌組織中ASB16-AS1 和miRNA-363-5p 表達的相關性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織中ASB16-AS1 和miRNA-363-5p表達情況的比較

鼻咽癌組織中ASB16-AS1 相對表達量明顯高于癌旁組織，miRNA-363-5p 相對表達量明顯低于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表1）。Pearson 相關分析結果顯示，鼻咽癌組織中ASB16-AS1 與miRNA-363-5p 的表達呈負相關（r=-0.992，P＜0.05）。

表1 鼻咽癌組織和癌旁組織中ASB16-AS1、miRNA-363-5p 相對表達量的比較（±s）

表1 鼻咽癌組織和癌旁組織中ASB16-AS1、miRNA-363-5p 相對表達量的比較（±s）

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2.2 C666-1 細胞增殖情況的比較

si-ASB16-AS1 組C666-1 細胞的ASB16-AS1 相對表達量為（0.31±0.02），明顯低于si-NC 組的（0.99±0.04），差異有統計學意義（t=26.336，P＜0.01），表明si-ASB16-AS1 轉染成功。si-ASB16-AS1組C666-1細胞的miRNA-363-5p相對表達量高于si-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1組C666-1細胞的OD值（48、72 h）、克隆形成數及Ki-67蛋白相對表達量均低于si-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1+antimiRNA-363-5p 組C666-1 細 胞 的miRNA-363-5p 相對表達量低于si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組，OD 值（48、72 h）、克隆形成數及Ki-67 蛋白相對表達量均高于si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1 組和si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組C666-1 細 胞 的miRNA-363-5p相對表達量、OD值（24、48、72 h）、克隆形成數及Ki-67 蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2、圖1、圖2）。

圖1 不同組別C666-1細胞的克隆形成情況

圖2 Western blot檢測不同組別C666-1細胞中Ki-67蛋白表達情況

表2 不同組別C666-1 細胞miRNA-363-5p 相對表達量、OD 值、克隆形成數及Ki-67 蛋白相對表達量的比較（±s）

表2 不同組別C666-1 細胞miRNA-363-5p 相對表達量、OD 值、克隆形成數及Ki-67 蛋白相對表達量的比較（±s）

注：a與si-NC組比較，P＜0.05；b與si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC組比較，P＜0.05

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2.3 C666-1 細胞凋亡情況的比較

si- ASB16- AS1 組C666- 1 細胞凋亡率和cleaved caspase 3 蛋白相對表達量均高于si-NC 組，pro-caspase 3 蛋白相對表達量低于si-NC 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1+antimiRNA-363-5p 組C666-1 細胞凋亡率和cleaved caspase 3 蛋白相對表達均低于si-ASB16-AS1+antimiRNA-NC 組，pro-caspase 3 蛋白相對表達量高于si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1 組和si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組C666-1 細胞凋亡率、cleaved caspase 3、pro-caspase 3 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表3、圖3、圖4）

圖3 不同組別C666-1細胞的凋亡情況

圖4 Western blot檢測不同組別C666-1細胞中cleaved caspase 3、pro-caspase 3蛋白表達情況

表3 不同組別C666-1細胞凋亡率及cleaved caspase 3、procaspase 3蛋白相對表達量的比較（±s）

表3 不同組別C666-1細胞凋亡率及cleaved caspase 3、procaspase 3蛋白相對表達量的比較（±s）

注：a與si-NC組比較，P＜0.05；b與si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC組比較，P＜0.05

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2.4 ASB16-AS1 靶向調控miRNA-363-5p 表達

ASB16-AS1 與miRNA-363-5p 的結合位點見圖5。共 轉 染WT-ASB16-AS1 的miRNA-363-5p 組C666-1 細胞熒光素酶活性明顯低于miRNA-NC組，差異有統計學意（P＜0.01）；共轉染MUTASB16-AS1 的miRNA-363-5p 組 與miRNA-NC 組C666-1 細胞熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

表4 不同組別C666-1 細胞熒光素酶活性的比較（±s）

表4 不同組別C666-1 細胞熒光素酶活性的比較（±s）

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圖5 ASB16-AS1與miRNA-363-5p基因序列的結合位點

3 討論

鼻咽癌的發生發展是一個多因素、多步驟的復雜過程，受多種基因調控，探討鼻咽癌相關基因及其作用機制可以為鼻咽癌的治療提供分子靶點。研究表明，GNAS-AS1[10]、LINC01385[11]和SNHG7[12]等多種lncRNA 在鼻咽癌組織中表達升高，能夠促進鼻咽癌的發生發展，而HCG11[13]、CASC2[14]等lncRNA在鼻咽癌組織中低表達，發揮抑癌基因的作用。ASB16-AS1 是近年來新發現的一種lncRNA，其在骨肉瘤[15]、宮頸癌[16]和肝癌[17]等惡性腫瘤中表達水平均升高，能夠促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，然而ASB16-AS1 對鼻咽癌的作用還未知。

本研究采用qRT-PCR 法檢測鼻咽癌組織中ASB16-AS1 的表達，結果顯示，鼻咽癌組織中ASB16-AS1 相對表達量明顯高于癌旁組織，提示ASB16-AS1 在鼻咽癌中發揮促癌作用。細胞異常增殖和凋亡率下降均是腫瘤發生發展的重要因素。Ki-67 與細胞周期調控有關，是細胞增殖標志物蛋白；caspase 是細胞凋亡的重要信號轉導通路，caspase 3 是該通路的關鍵調控分子，其被激活后啟動細胞凋亡[18-19]。本研究探討了干擾ASB16-AS1對鼻咽癌C666-1 細胞增殖和凋亡的影響，結果顯示，干擾ASB16-AS1 可降低鼻咽癌C666-1 細胞OD值、克隆形成數及Ki-67 蛋白表達，提高鼻咽癌C666-1 細胞凋亡率和cleaved caspase 3 蛋白表達，同時降低pro-caspase 3 蛋白表達，說明干擾ASB16-AS1 可有效抑制鼻咽癌細胞增殖，促進鼻咽癌細胞凋亡，提示ASB16-AS1 有可能成為鼻咽癌治療的分子靶點。

為進一步探究干擾ASB16-AS1 表達抑制鼻咽癌細胞的分子機制，本研究證實了ASB16-AS1 在細胞中靶向結合miRNA-363-5p 并負調控其表達，這與鼻咽癌組織中ASB16-AS1 與miRNA-363-5p表達呈負相關的結果一致。研究顯示，過表達miRNA-363-5p 可抑制口腔鱗狀細胞癌增殖[20]；miRNA-363-5p 低表達與肝癌患者的總生存期更長有關，可能是肝癌的潛在預后標志物[21]；隨著膠質瘤腫瘤級別的增高，miRNA-363-5p 表達水平逐漸上調[22]。本研究結果還顯示，同時干擾miRNA-363-5p 和ASB16-AS1 表達后，C666-1 細胞的增殖能力強于僅干擾ASB16-AS1 表達的細胞，而凋亡程度低于僅干擾ASB16-AS1 表達的細胞，提示干擾ASB16-AS1 可通過下調miRNA-363-5p 的表達控制鼻咽癌細胞增殖及凋亡。

綜上所述，鼻咽癌組織中ASB16-AS1 表達升高，而miRNA-363-5p 表達降低。ASB16-AS1 通過調控miRNA-363-5p 增強鼻咽癌細胞的增殖能力，并抑制細胞凋亡。本研究尚存在不足之處，接下來將進一步探究miRNA-363-5p 的靶基因及下游信號通路對鼻咽癌的影響，并通過動物實驗驗證ASB16-AS1/miRNA-363-5p 通路在鼻咽癌發生發展中的作用。