野杏經濟性狀SSR 關聯分析及優異等位變異挖掘

董勝君，溫佳星，盧彩云，陳建華，劉權鋼，金 玲

（沈陽農業大學 林學院，遼寧 沈陽 110866）

野杏Armeniaca vulgaris是薔薇科杏屬植物中普通杏的一個變種，落葉喬木，一般生長在亞熱帶地區，丘陵地帶，主要分布在我國北部地區，栽培或野生[1]。野杏喜光，對土壤的適應性強，根系發達，是重要的造林先鋒樹種，具有較高的生態價值。其果實含糖量高；果肉中黃酮類成分的質量分數高達269.7 mg/g，具有防動脈硬化、抗脂肪氧化及活化大腦等功能；杏仁可供食用及作為預防心血管疾病和降低膽固醇等的藥物[2]。此外，野杏也可作為觀賞樹種栽培，具有重要的經濟價值和社會價值。

野杏分布廣泛，種質資源豐富，但多處于野生、半野生狀態，自交不親和、種內雜交現象普遍，易形成較高水平的遺傳變異和較低水平的連鎖不平衡[3]。因此，在進行野杏資源的開發利用時，首先要進行優良親本的選育。傳統的野杏育種方法主要為憑借育種經驗根據表型選擇后代進行栽培，表型性狀與基因型之間的關系不明確，無法對目的性狀進行直接選擇，選擇效率低，準確性差，且因生長周期長，選育出優良的野杏品種需要較長時間。簡單重復序列（SSR）亦稱微衛星DNA，SSR 標記的靈敏度高、多態性高且技術簡便易操作，已在密葉紅豆杉Taxus contorta[4]、美國紅楓Acer rubrum[5]等樹種的研究中得到應用，是分子標記輔助育種以及發掘優良性狀等位變異的較好的標記方法[6]，艾鵬飛等[7]建立和優化了仁用杏的SSR 標記反應體系，何天明等[8]則利用SSR 標記對新疆栽培杏品種亞群進行了分子系統學研究。基于連鎖不平衡將標記與性狀關聯起來的分析方法被稱為關聯分析[9]，該方法精度高、周期短，不用構建載體，可同時檢測同一位點的多個等位基因[10]，已被廣泛應用于大麥Hordeum vulgare[11]、大豆Glycine max[12]、玉米Zea mays[13]等 作 物 及 板 栗Castanea mollissima[14]、 桃 樹Amygdalus persica[15]、野蘋果Malus sieversii[16]等木本植物的研究中，為復雜的數量性狀基因定位和分子標記輔助育種提供了快捷、有效的途徑。但通過SSR 關聯分析僅能在分子水平上找到與性狀相關聯的位點，在選育優良親本個體時，仍要進行表型效應分析，進而挖掘出典型載體材料。目前，表型效應分析及載體材料挖掘多見于作物研究中，如陸地棉Gossypium hirsutum[17]、辣椒Capsicum annuum[18]、大 麥Hordeum vulgare[11]、大豆Glycine max[12]等，木本植物中僅見椰子Cocos nucifera[19]、小 葉 楊Populus simonii[20]、杉木Cunninghamia lanceolata[21]等少數樹種有相關研究。在杏屬植物的研究中：蔣江照等[22]利用關聯分析研究了有效積溫對小白杏果實品質的影響；張欣[23]對西伯利亞杏SSR 標記與表型性狀進行關聯分析，找到了與表型相關的SSR 位點；表型效應分析僅見金玲[24]挖掘了攜帶西伯利亞杏果實優異等位基因的典型載體材料。

目前，應用關聯分析發掘與野杏重要經濟性狀相關聯位點的研究報道較少，野杏表型效應分析的相關研究更是鮮見報道。本研究中以40 個野杏無性系為研究對象，利用120 對SSR 引物進行擴增、標記，采用Tassel 軟件中的GLM 模型對SSR 標記與20 個重要經濟性狀進行關聯分析，并進行等位變異表型效應分析，發掘攜帶野杏優良經濟性狀基因的典型載體材料，以期全面系統地分析已有的育種材料，了解表型性狀與基因型之間的聯系，為野杏分子標記輔助育種和良種選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自沈陽農業大學喀左縣山杏國家林木種質資源保存庫。供試野杏無性系編號及種源信息見表1。

表1 供試野杏無性系編號及種源信息Table 1 The information of No. and provenances of tested A. vulgaris

1.2 試驗方法

1.2.1 SSR 引物數據獲得

基于沈陽農業大學山杏課題組前期對野杏群體的SSR 分子標記開發，委托北京賽百盛基因技術有限公司合成SSR 引物，進行PCR 擴增（于2017 年完成），從中篩選出120 對擴增效果好、多態性高的引物數據。

1.2.2 經濟性狀測定

2018—2020 年，在試驗地觀測40 個野杏優良無性系，每個無性系選擇3 次重復。成熟期采集果實，每樣本采集20 個果實，用數顯卡尺測量果長（fruit length，FL）、果寬（fruit width，FW）、果厚（fruit thickness，FT）、果 肉 厚 度（flesh thickness，FLT）、核長（nutlet length，NL）、核寬（nutlet width，NW）、核厚（nutlet thickness，NT）、仁長（kernel length，KL）、仁寬（kernel width，KW）、仁厚（kernel thickness，KT），用電子天平測定單果質量（single fruit mass，SFM）、單核質量（single nutlet mass，SNM）、單仁質量（single kernel mass，SKM），計算果形指數（fruit-form index，FFI）、核形指數（nucleation index，NCI）、仁形指數（kernel-form index，KFI）、出核率（nutlet rate，NR）、出仁率（kernel rate，KR）、產果量（fruit yield，FY）、產核量（nutlet yield，NY）。

1.3 數據處理

1.3.1 關聯分析

使用Structure 2.3 軟件計算各無性系的Q值。運用TASSEL 2.1 軟件的GLM 模型，以Q值作為協變量，進行SSR 標記與經濟性狀的關聯分析。

1.3.2 等位變異的表型效應分析

參考無效等位基因（null allele）法，計算關聯標記的各等位變異的表型效應值，獲得與野杏重要經濟性狀關聯等位變異的表型效應，再根據表型效應值找出最優無性系，獲得典型載體材料。

式中：ai為第i個等位變異的表型效應值；xij為攜帶第i個等位變異的第j個材料的性狀表型測定值；ni為具有第i個等位變異的材料數量；Nk為攜帶無效等位變異的第k個材料的表型測定值；nk為具有無效等位變異的材料數量。若ai為正，則認為該等位變異為正向等位變異，反之為負向等位變異。

2 結果與分析

2.1 野杏經濟性狀與SSR 標記的關聯分析

供試野杏樣本的經濟性狀均值見表2。與野杏經濟性狀顯著關聯的SSR 位點見表3。由表3 可知，共檢測出43 個與野杏經濟性狀極顯著關聯的SSR 位點（P＜0.01），有9 個與產果量呈極顯著相關聯的位點，有7 個與仁厚呈極顯著相關聯的位點；共檢測出64 個與野杏經濟性狀顯著關聯的SSR 位點（P＜0.05），除果形指數外其他性狀均與多個SSR 關聯位點顯著相關，與核寬顯著關聯的位點最多（18 個），產果量次之（17 個）。有40 個位點分別與多個性狀相關聯，其中：P1 位點與仁長、單仁質量等7 個性狀相關聯；X36 位點與核厚、出核率等7 個性狀相關聯；L62H 位點與核長、核寬等6 個性狀相關聯；Y86、X16H、Y17、L45H、L7 位點分別與5 個性狀相關聯；L49H、L57H、X19H 分別與4 個性狀相關聯；L25、L46、L59H、L62、P39H、X15H、X39H、X132、Y11、Y65 分別與3 個性狀相關聯。

表2 供試野杏無性系20個經濟性狀均值Table 2 Mean value of 20 economic traits of tested A. vulgaris

續表2Continuation of Table2

表3 與供試野杏經濟性狀顯著關聯的SSR位點Table 3 SSR loci associated significantly with economic traits of tested A. vulgaris

在20 個經濟性狀中，與果實性狀相關聯的位點有36 個，變異解釋率為17.03%～48.96%，其中，果長、果寬、果厚、果肉厚度、果形指數、單果質量分別與Y17（47.35%）、P39H（40.36%）、X11H（39.54%）、X36H（48.96%）、X53H（37.46%）、Y17（47.17%）位點的變異解釋率最高。與果核性狀相關聯的位點有42 個，變異解釋率為15.67%～57.21%，其中，核長、核寬、核厚、核形指數、單核質量、出核率分別與L7（47.17%）、L7（57.21%）、X15H（54.73%）、Y11（31.81%）、L7（36.47%）、X42H（56.35%）位點的變異解釋率最高。與果仁性狀相關聯的位點有37 個，變異解釋率為14.77%～61.42%，其中，仁長、仁寬、仁厚、仁形指數、單仁質量、出仁率分別與Y17（42.69%）、L7（43.96%）、X34H（54.60%）、X34H（36.75%）、X39H（61.42%）、L79H（56.98%）位點的變異解釋率最高。與產量性狀相關聯的位點有31 個，變異解釋率為12.21%～77.78%，其中，X44H 標記與產果量、產核量的最高變異解釋率分別為74.21%、77.78%。

2.3 野杏經濟性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應分析

2.3.1 果實性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應值

果實性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應值見表4。由表4 可知：與果長相關的表型效應有10 個，表型效應值為-0.73 ～0.43，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為241 號（Y65-158）和164 號（Y17-130）無性系；與果寬相關的表型效應有18 個，均為負向效應，最低表型效應值為-0.87，典型載體材料為210 號（P39H-150）無性系；與果厚相關的表型效應有21 個，表型效應值為-0.55 ～0.89，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為210 號（X11H-122）和164 號（Y86-146）無性系；與果肉厚度相關的表型效應有32 個，表型效應值為-0.32 ～0.43，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為241 號（Y65-158）和211 號（X36H-110/X36H-122）無性系；沒有與果形指數相關的表型效應；與單果質量相關的表型效應有10 個，表型效應值為-7.80 ～6.07，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為232號（Y17-120）和164 號（Y17-130）無性系。

表4 供試野杏果實性狀SSR關聯位點等位基因的表型效應值Table 4 Phenotypic effects of alleles of SSR loci associated with fruit traits of tested A. vulgaris

2.3.2 核性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應值

核性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應值見表5。由表5 可知：與核長相關的表型效應有16個，表型效應值為-0.84 ～1.02，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為210 號（L7-117）和207 號（Y86-126）無性系；與核寬相關的表型效應有58 個，表型效應值為-0.58 ～1.05，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為210 號（L7-117）和207 號（Y86-126）無性系；與核厚相關的表型效應有2 個，均為負向效應，最低表型效應值為-0.08，典型載體材料為210 號（L49H-123）無性系；與核形指數相關的表型效應有8 個，表型效應值為-0.11 ～0.06，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為197 號（L62-144）和248 號（Y11-158）無性系；與單核質量相關的表型效應有7 個，表型效應值為-0.72 ～0.60，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為210 號（L7-117）和261 號（L57H-120）無性系；與出核率相關的表型效應有22 個，表型效應值為-9.96 ～9.29，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為171號（X16H-122）和120 號（X36H-108）無性系。

表5 供試野杏核性狀SSR關聯位點等位基因的表型效應值Table 5 Phenotypic effects of alleles of SSR loci associated with nuclear traits of tested A. vulgaris

2.3.3 仁性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應值

仁性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應值見表6。由表6 可知：與仁長相關的表型效應有5個，表型效應值為-0.20 ～0.17，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為232 號（Y17-120）和164 號（Y17-130）無性系；與仁寬相關的表型效應有22 個，表型效應值為-0.29 ～0.17，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為198 號（L7-123）和207 號（L46-153）無性系；與仁厚相關的表型效應有38 個，表型效應值為-0.07 ～0.37，負向效應的典型載體材料為164 號（P21-128）或162 號（X19H-130），正向效應的典型載體材料為248 號（P39H-144）無性系；與仁形指數相關的表型效應有11 個，表型效應值為-0.19 ～0.14，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為207號（L62H-132）和247 號（X34H-144）無性系；與單仁質量相關的表型效應有32 個，表型效應值為-0.19 ～0.42，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為210 號（L7-117）和207 號（Y86-126）無性系；與出仁率相關的表型效應有18 個，表型效應值為-8.01 ～8.99，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為245 號（L25-124）和167 號（L25-112）無性系。

表6 供試野杏仁性狀SSR關聯位點等位基因的表型效應值Table 6 Phenotypic effects of alleles of SSR loci associated with kernel traits of tested A. vulgaris

2.3.4 產量性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應值

產量性狀SSR 關聯位點等位基因的表型效應值見表7。由表7 可知：與產核量相關的表型效應有36 個，表型效應值為-145.61 ～582.68，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為263 號（X21H-134）和162 號（X19H-130）無 性 系；與產果量相關的表型效應有40 個，表型效應值為-1 501.23 ～4 429.39，負向效應和正向效應的典型載體材料分別為198 號（Y54-108）和162 號（X19H-130）無性系。

表7 供試野杏產量性狀SSR關聯位點等位基因的表型效應值Table 7 Phenotypic effects of alleles of SSR loci associated with yield traits of tested A. vulgaris

3 結論與討論

本研究中基于120 個SSR 標記通過關聯分析獲得了與野杏20 個經濟性狀相關聯的64 個SSR位點，通過表型效應分析發掘了406 個優異等位變異和18 個典型載體材料。

關聯分析已被廣泛應用于探索表型性狀與基因型之間的關系，近年來已有較多相關報道[25-26]。使用該方法可以同時對多個性狀進行定位，使等位變異更加豐富，還可以得到更多的關聯位點，能夠發現使用相關分析和連鎖分析等技術手段無法得到的、隱藏在表型數據之下的遺傳變異。本研究中通過關聯分析檢測到了多個與野杏經濟性狀相關聯的位點。解釋率越大，性狀與位點的相關性越強，關聯結果中與仁厚關聯位點的平均變異解釋率最大（45.53%），與單核質量關聯位點的平均變異解釋率最小（23.81%），說明供試野杏群體遺傳水平差異較大。有17 個位點對表型變異的解釋率在50%以上，其中與產果量和產核量關聯的X44H 位點的變異解釋率最高，分別為74.21%和77.78%，均在70%以上。除果形指數外的19 個性狀均有多個SSR 關聯位點，說明這些性狀可能受到多基因調控或者受連鎖群內及連鎖群間的連鎖調控，這與其他學者對大麥Hordeum vulgare[11]、辣椒Capsicum annuum[18]、水稻Oryza sativa[27]的研究結果類似。另外，有44 個位點分別與多個性狀相關聯，前人在研究西伯利亞杏Armeniaca sibirica[24]、荷花NelumboAdans.株型[28]、玉米Zea mays[29]時也發現與多個性狀存在“一因多效”或連鎖關系的位點基因，這些與同一位點相關聯的多個性狀可能存在連鎖遺傳。本研究中最終獲得了多個與野杏經濟性狀相關聯的位點，位點基因與性狀之間的關系多樣且復雜。

本研究中在關聯分析的基礎上，對得到的關聯位點進一步進行解析，分析其表型效應，挖掘優異等位變異。Breseghello 等[30]在2006 年首次提出用無效等位基因的方法分析表型效應，隨后該方法被廣泛應用于挖掘攜帶優異等位變異的典型載體材料。Zhou 等[19]在椰子Cocos nucifera果肉脂肪酸含量的研究中挖掘出了具有最大正向效應和最大負向效應的典型載體材料；衛尊征[20]在獲得17 個與小葉楊P. simonii葉、莖和根性狀極顯著關聯位點的基礎上進行表型效應分析，挖掘出了相關典型載體材料；張勝龍[21]在研究杉木Cunninghamia lanceolata材質性狀變異規律時挖掘出了3 個材質性狀和3 個木材生長性狀的典型載體材料；在杏屬植物的相關研究中，僅見金玲[24]采用155 個SSR 分子標記對32 個西伯利亞杏A. sibirica無性系的表型性狀進行關聯分析，得到49 個與13 個經濟性狀顯著關聯的位點，并挖掘出6 個攜帶優異等位變異的典型載體材料。本研究結果表明，所發掘的406 個有效等位變異中，122 個有效等位變異同時對多個性狀產生正向或負向效應。在17 個典型載體材料中，210 號典型載體材料攜帶了7 個優異等位變異，207 號、164 號典型載體材料攜帶了5 個優異等位變異，162 號典型載體材料攜帶了3 個優異等位變異，232 號、241 號、248 號、198 號等典型載體材料均攜帶了2 個優異等位變異。這些載體材料攜帶優異基因較多，屬于優異親本。可以利用發掘出的典型載體材料進行有性雜交和連續回交，聚合更多的優異基因。例如，利用164 號無性系和162 號無性系雜交選育大果且高產的品種，利用207 號無性系和248號無性系雜交選育仁用杏品種等。這些優異等位變異的聚合可以實現多個目標性狀的同步改良，從而加速野杏優良品種選育的進程。

本研究中通過關聯分析和表型效應分析找到了與野杏經濟性狀相關聯的SSR 位點及優異等位變異，但各等位變異調節野杏經濟性狀的機制，各等位變異間的連鎖遺傳關系等尚未有明確的答案，后續可以利用克隆、遺傳轉化、酵母單雙雜交等基因工程技術對這些等位變異的功能進行驗證，并對其相互作用進行研究。