金桂根際土壤解磷菌對金桂幼苗生長及其內源激素的影響

王曉念，甘麗萍，陳代平，唐 恒，袁 瑩，江潤珍

（重慶三峽學院 a. 生物與食品工程學院；b. 體育與健康學院；c. 財經學院，重慶 萬州 404100）

金桂Osmanthus fragransLour. 屬于木犀科Oleaceae 木犀屬Osmanthus，是集綠化、美化、香化為一體的經濟物種。金桂具有極高的經濟價值和觀賞價值：其花、果和根都可入藥，其花還可用來制作糕點和花茶；金桂枝葉濃密，花香色艷。金桂抗逆性強，適生范圍廣，還是山體造林和水土涵養的優良樹種。

植物的整個生命周期都離不開磷元素。土壤中的磷元素主要以有機磷和無機磷兩種形式存在。在其被施入土壤中的當季，磷肥的利用率約為25%；殘留的磷元素在酸性土壤中易被螯合固定，以難溶性的礦石或有機物的形式存在，植物難以吸收利用[1-3]。而土壤中存在的解磷菌（Phosphate solubilizing bacteria，PSB）能將磷轉化為可吸收利用的形態[4]。解磷細菌能分泌一些植物生長素，促進植物的生長與代謝，改善植物的多種農藝性狀并促進植物的生長發育，還能提高部分農作物的產量。根際細菌和菌根真菌的相互作用可以促進植物生長，改善植物與其根際土壤的養分狀況，影響根際土壤的微生物環境[5]。PSB 對小麥[6]、高粱[7]等多種農作物生長量與產量的增加和提高都有促進作用。在木本植物中，解磷微生物不僅能夠增加土壤中可溶性磷的含量，其自身也能在林木根際周圍形成優勢種群，可以增強林木的抗病能力[8]。在微生物生長過程中加入適量生長調節劑，能夠促進其細胞的新陳代謝，促進微生物的分裂與增殖，提高菌體的生長速度和產酶能力[9]。生長調節劑影響著菌體的生長、發育與成熟等，也將直接影響著甾體轉化酶的活性和甾體底物的轉化。因此，篩選出適合不同植物生長所需的PSB，構建并完善解磷微生物的菌種資源庫，可以有效提高磷的轉化利用率，還能緩解我國磷肥資源緊缺及生態環境被破壞的問題[10]，推動國家關于農藥化肥雙減雙控政策的實施，提高環保高效的生物菌肥的利用效率，減少農藥用量，促進綠色農業、生態農業、環保農業的發展。

目前，對土壤解磷菌的研究主要集中在無機磷菌株的篩選[11]，所研究的作物主要為小麥[7]、高粱[8]等，且所研究的生物菌肥多用于豆科、茄科等作物的生產中[12-13]。但是，有關經濟植物和觀賞植物根際解有機磷細菌的研究報道均較少，且相關研究內容主要為解磷能力與菌株基因功能[14]、菌株產生有機酸等代謝途徑的改變進而促進植物生長[15]及鈍化重金屬[16]等方面，這嚴重制約著經濟植物和觀賞植物生物菌肥的開發與利用。而生長調節劑已經廣泛應用于植物和動物的生長發育與調控之中，如發酵菌種黑根酶催化甾體微生物的轉化反應[17]，該復合型生長調節劑的添加，可以促進菌體的生長，提高底物的轉化效果。然而，有關解磷細菌對桂樹生長發育的影響及其與植物體中激素的關系以及植物生長調節劑（生長素類）對PSB 是否有影響等問題的研究尚未見諸報道。為了獲得適合金桂生長的高效解有機磷細菌，提高土壤磷素利用率，為微生物磷肥的開發提供高效的菌種資源，本研究從金桂根系土壤中分離純化解有機磷細菌，并將其制成菌液添加到金桂插穗與移栽苗的培養土壤中，觀察解有機磷細菌對金桂插穗與移栽苗生長的影響情況，分析PSB 對金桂樹體內源激素含量的影響情況和外源激素對PSB 生長繁殖的影響情況，以明確PSB 促進金桂插穗和移栽苗生長的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 金桂材料的采集

供試樹種為重慶三峽學院校園內栽培的金桂O. fragransLour，2020 年5 月采集其種子并沙藏以備用。2020 年9 月上旬，以棋盤式隨機取樣法選取7 年生的金桂樣樹9 株，采集其上部1 年生枝條以備扦插之用。

1.1.2 土壤樣品的采集

以選定的金桂樣樹樹冠投影邊線為界線，除去土壤表層的枯枝落葉和灌木草本植被等雜物，采用掘根抖落的方法，挖取深度為 10 ～20 cm 的毛細根，收集金桂樣樹根際土壤樣品并裝入無菌袋中，每株樣樹各收集1 份土壤樣品，每份土壤樣品各100 g，共收集9 份土壤樣品，其編號分別為#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9。將 采集的土壤樣品帶回實驗室保存于4 ℃的冰箱中，以用于后續PSB 的分離與篩選。

1.1.3 試 劑

生根粉（ABT-1），購自中國林業科學研究院，將其濃度分別配制為100、150、200 mg·L-1以備用。

1.1.4 培養基

有機磷液體培養基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·2H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，CaCO3卵磷脂0.2 g，酵母膏0.4 g，雙蒸水1 000 mL，pH值為7.0。

有機磷固體培養基：在有機磷固體培養基里加入20 g 瓊脂。

細菌基礎培養基（LB 培養基）：參照有關文獻中的配方[18]配制而成。

1.2 方 法

1.2.1 PSB 的分離純化、復篩與鑒定

分別稱取10 g 土樣放入裝有90 mL 無菌水的滅菌三角瓶中，置于搖床中以200 r·min-1的轉速振蕩40 min，即得到0.1 倍的土壤稀釋液，并依次稀釋至合適的倍數。靜置2 min 后，移取0.1 mL的土壤稀釋液，將其均勻地涂布于已滅菌的有機磷固體培養基上，置于28 ℃的恒溫培養箱中培養48 h。挑取有透明圈的單菌落，純化3 代后，將純化的菌株接種到LB 培養基上，然后將其置于4 ℃的冰箱中保存以備用。采用溶磷圈法，將待測菌株點接于有機磷培養基上，于28 ℃的恒溫培養箱中培養72 h 后，再將其接種于LB 培養基上，接種48 h 后，觀察并記錄菌落的形狀、大小、邊緣特征等，然后對純化的菌株進行革蘭氏染色處理，觀察其形態，并進行生理生化試驗。選取5 個長勢較好、解磷能力較強的菌株培養72 h，調查其生長時長。

1.2.2 PSB 對金桂插穗生長及其內源激素的影響的試驗設計

選取金桂當年新生枝條，剪成長度約為8 cm、帶有2 ～3 個葉芽的莖段，保留上部2 片葉，剪去葉片總長度的一半，將已剪好的金桂插穗用0.5%的高錳酸鉀溶液浸泡24 h 后再用清水沖洗5 min以備用。采用4 份河沙＋3 份腐葉土＋3 份珍珠巖的配方配制所用基質，將配制好的基質置于陽光直射下暴曬消毒后裝入上口徑為15 cm、下直徑為10 cm、高為8 cm 的塑料花盆中，再將浸泡好的插穗插入基質中，插入深度為3 ～4 cm，每個花盆各插入2 段插穗，然后將其置于正常的生長環境下培養，共培養100 盆。

利用有機磷液體培養基培養PSB，培養完成后加入無菌水洗脫，并用脫脂棉過濾，制備成PSB 菌液，將其濃度分別稀釋為103、106、109CFU·mL-1，其處理組編號分別為A、B、C。扦插7 d 后，每盆中各加入不同濃度的PSB 菌液150 mL，以加入清水的為對照（CK）組。A、B、C 組及對照組各重復25 盆，分別于培養7、15、25、35、45、55 d 時取樣，清洗處理后的插穗，并于距離基部2 cm 處切片，將其保存于-70 ℃的超低溫冰箱中以備用。采用HPLC 分析法測定插穗中生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）這3 種內源激素的含量[19]，重復3 次。于扦插60 d 后統計金桂插穗的成活率及生根數。

1.2.3 PSB 對金桂移栽苗生長的影響的試驗設計

采用上述方法，將稀釋好的3 種濃度（103、106、109CFU·mL-1）的PSB 菌液分別接種于金桂移栽苗的培養土中，然后將已接種PSB 菌液的栽培土裝入花盆中（每個花盆各裝土壤5 kg），再將株高為（300±50）mm 的金桂移栽苗栽入花盆中，每盆分別澆水1 000 mL，在每個花盆中再加入已配好的PSB 菌液150 mL，每個處理組重復栽培25 盆，分別于盆栽30 、60 、90、180 d 時測量移栽苗的根系數量。待金桂移栽苗在接種了PSB 的土壤中生長180 d 后，挖出移栽苗，測量其地上部分和地下部分的總鮮質量、總干質量和葉片中的全磷含量。用H2SO4-H2O2消煮法處理金桂移栽苗葉片，采用鉬銻抗比色法[19]測定葉片中的磷含量。

1.2.4 PSB 與外源激素的協同作用對金桂插穗的影響的試驗設計

選取最能促進金桂插穗和移栽苗生長的濃度為106CFU·mL-1的 PSB 菌液1 mL，將其添加到牛肉膏蛋白胨培養基中，然后加入濃度分別為100、150、200 mg·L-1的生根粉1 號（ABT-1）溶液，每組各設3 次重復，以加入無菌水的為對照。扦插方法同1.2.3 段所述，每組重復試驗25 盆，扦插前將插穗浸泡3 h，以清水浸泡插穗為對照。待插穗生長60 d 后調查其成活率與根數量。

1.3 數據處理與分析

采用Excel 軟件進行數據統計與分析，采用Photoshop 2021 軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 金桂根際土壤中PSB 的分離純化結果

從9 份金桂樣樹根際土壤樣本中共分離得到PSB 菌 株19 株，分 別 編 號 為YB1、YB2、YB3……YB19，各個菌株的菌體形態和菌落特征見表1。選取5 個長勢較好的菌株，將其置于平板上培養，結果如圖1 所示。

圖1 平板培養的5株PSB菌株的菌落形態Fig. 1 Colony morphology of five PSB strains cultured on plate

表1 金桂樣樹根際土壤樣本中分離出的PSB菌株的菌體形態和菌落特征Table 1 Morphology and colony characteristics of PSB strains isolated from rhizosphere soil samples of O. fragrans

由表1可知，菌體的形態分別呈桿狀和橢圓形，菌落周邊規則或不規則，菌落顏色為乳白色或白色，菌落表面都濕潤，解磷圈的顏色為無色或者乳白色。將菌株進行革蘭氏染色后，菌株的菌體多呈橢圓狀、長桿狀、短桿狀這3 種形狀，僅有1 株菌體呈球形。

對選取的5 個菌株的生長速度進行調查，結果如圖2 所示。由圖2 可知，隨著菌株生長時間的增加，菌落的數量均有增加；當其生長時間為0 ～16 h 時，其菌落數的增長速度均較緩慢；當其生長時間為16 ～40 h 時，其增長速度均最快；當其生長時間為40 ～56 h 時，其增長速度均變緩；當其生長時間為56 h 時，其PSB 菌落的數量均達到最大值；在其生長時間為56 h 后，其PSB菌落的數量基本保持不變。

圖2 金桂樣樹根際土壤中分離出的5株PSB菌株的生長速度Fig. 2 Growth rate of 5 PSB strains in rhizosphere soil of O. fragrans

2.2 PSB 濃度對金桂插穗成活與生根的影響

在金桂插穗培養土壤中添加一定濃度（103～106CFU·mL-1）的PSB 菌液，對金桂插穗的成活率與根數量都有一定程度的影響，試驗結果如圖3所示。由圖3 可知，當PSB 濃度為106CFU·mL-1時，插穗成活率達到了78%，較其對照組提升了37%左右，此時根的數量也增加了83%，不同濃度處理組的成活率與根系數量均存在顯著性差異；當其濃度上升到109CFU·mL-1時，不同濃度處理組的成活率與根系數量均迅速下降，金桂插穗的成活率均不到50%，其根系數量均下降了50%，說明高濃度的PSB對金桂插穗反而會起到抑制作用。

圖3 解磷菌濃度對金桂插穗成活率和根系數量的影響Fig. 3 Effects of concentration of phosphate solubilizing bacteria on survival rate of cuttings and number of roots of O. fragrans

2.3 PSB 濃度對金桂插穗中3 種內源激素含量的影響

接種到培養土壤中的解磷菌的濃度對金桂插穗中的生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）這3 種內源激素含量的影響情況如圖4 所示。

由圖4 可知，扦插初期，插穗中IAA 的含量，對照CK（未添加PSB 菌液）組與處理組的都在增加；扦插0 ～25 d，A（PSB 濃度為103CFU·mL-1）、B（PSB 濃度為106CFU·mL-1）、C（PSB 濃度為109CFU·mL-1）組插穗中IAA 的含量均呈上升趨勢，但 CK 與C 組的IAA 含量均明顯低于A、B 組的；且CK、C 組與A、B 組之間插穗中IAA 的含量差異較大，A、B 兩組插穗的基部均明顯膨大。扦插25 d 后，A、B 組插穗中IAA的含量均先呈下降趨勢而后卻一直保持上升趨勢，而CK 與C 組插穗中IAA 的含量始終均無明顯的上升趨勢。A 與B 兩組插穗的成活率和生根率均明顯高于CK 與C 組的。由此可知，在培養土壤中接種一定濃度的PSB，能提高插穗中IAA 的含量。

圖4 接種不同濃度的解磷菌對金桂插穗中3種內源激素含量的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of phosphate solubilizing bacteria on the content of endogenous hormones in O. fragrans cuttings

插穗中ABA 的含量，C 組明顯高于其他3 組，C 組與A、B、CK 組之間插穗中ABA 的含量差異均較大，說明C 組插穗的存活數與生根數都是最少的，表明濃度過高的PSB 會影響ABA 的合成，對插穗生根起著抑制作用；而B 組插穗中ABA 的含量始終低于其他3 組的，C 組插穗中ABA 的含量略低于CK 組的，說明濃度為103～106CFU·mL-1的PSB 在一定程度上抑制了ABA 的合成。

插穗中GA 的含量，A、B、C 組均呈現出先增加后減少的變化趨勢，扦插15 d 后其含量均達到最高值，隨后一直減少，此時正是插穗大量形成不定根的時候。A、B 組插穗中GA 的含量始終低于CK 組的，且B 組與CK、A、C 組的相比差異明顯；而C 組插穗中GA 的含量始終高于CK 組的。這一結果與前文所述C 組插穗的存活率與生根數均不及CK 組的結果一致，說明較低水平的GA對其生根具有一定的促進作用，而濃度為103～106CFU·mL-1的PSB 在一定程度上抑制了插穗生根時GA 的合成。

2.4 PSB 濃度對金桂移栽苗根系生長與各項生理指標的影響

分別在金桂移栽苗生長30、60、90 和180 d時測定每組移栽苗的根系數量，結果如圖5a 所示。由圖5a 可知，在金桂移栽苗生長30 和60 d后，與CK（未添加PSB 菌液）組相比，A（PSB 濃度為103CFU·mL-1）、B（PSB 濃度為106CFU·mL-1）、C（PSB 濃度為109CFU·mL-1）組移栽苗根系數的差異都沒有達到顯著水平；在移栽苗生長90 d 時，B、C 組的根系數量與CK、A 組的根系數量的差異均達到了顯著水平（P＜0.05）；到移栽苗生長180 d 時，B、C 組與CK、A 組的根系生長均保持著與之前相同的變化趨勢，PSB 濃度分別為109與106CFU·mL-1的處理組間其根系數的差異也達到了顯著水平（P＜0.05），表明濃度越高，PSB 對金桂移栽苗根系生長的促進作用越大，且能持續促進金桂根系的生長。

在金桂移栽苗接種解磷菌180 d 后，4 個組的金桂移栽苗的生長狀態如圖5b 所示。從圖5b中可以看出，金桂移栽苗接種解磷菌后，解磷菌對移栽苗根系的生長起到了一定的促進作用，當PSB 濃度為109CFU·mL-1時，移栽苗的根部生長更為旺盛、增粗明顯，新生根的數量更多，說明接種PSB 對金桂移栽苗的生長極其有益，且PSB的濃度在適宜范圍內越高越好。隨著金桂插穗的生長發育，所需PSB 濃度也在逐漸增加，但移栽苗在不同生長時期所需PSB 的濃度有差異。

圖5 不同濃度的PSB菌液對金桂移栽苗生長的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of PSB on the growth of transplanted seedlings of O. fragrans

在金桂移栽苗接種解磷菌180 d時對金桂移栽苗的各項生長與生理指標進行了測定，結果如圖6 所示。由圖6 可知，A（PSB 濃度為103CFU·mL-1）、B（PSB 濃度為106CFU·mL-1）、C（PSB 濃度為109CFU·mL-1）組金桂移栽苗地上部分和地下部分的總鮮質量較對照（未接種解磷菌，CK）組的分別高出1.5%、15.8%、28.6%，且B、C 組與CK組間其差異均達到了顯著水平（P＜0.05）；A、B、C 組移栽苗地上部分和地下部分的總干質量較對照（CK）組的分別高出2.2%、18.3%、38.9%，且B、C 組與CK 組間其差異達到了顯著水平（P＜0.05）。A、B、C 組移栽苗葉片中的全磷含量較對照（CK）組的分別高出3.1%、28.1%、46.9%，且B、C 組與CK 組之間其差異均達到了顯著水平（P＜0.05）。同時，B 組和C 組的移栽苗在其地上部分和地下部分的總鮮質量、總干質量和葉片中全磷含量的差異也都達到了顯著水平（P＜0.05）。

圖6 不同濃度的PSB菌液對金桂移栽苗各項生長與生理指標的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of PSB bacteria on growth and physiological indexes of transplanted seedlings of O. fragrans

2.5 外源激素ABT-1 與PSB 的協同作用對金桂插穗成活與生根的影響

濃 度 為106CFU·mL-1的PSB 與 不 同 濃 度 的ABT-1 的協同作用對金桂插穗成活率和生根數都有一定程度的影響，試驗結果如圖7 所示。從圖7中可以看出，ABT-1（150 mg·L-1）+PSB 處理組合的插穗成活率顯著高于其他處理組合的；從根系數量來看，ABT-1（100 mg·L-1）+PSB 處理組合的插穗根系數顯著高于其他處理組合的。這一試驗結果說明，濃度為100 ～150 mg·L-1的ABT-1 與濃度為106CFU·mL-1的PSB 的協同作用能夠有效促進插穗的成活與生根。

圖7 不同濃度的外源激素ABT-1和濃度為106CFU·mL-1的PSB的不同處理組合對金桂插穗成活率和根系數的影響Fig. 7 Effects of different combinations of exogenous hormone ABT-1 and PSB with concentration of 106 CFU·mL-1on cuttings survival rate and root number of O. fragrans

3 結論與討論

本研究從金桂根際土壤中共分離得到19 個PSB 菌株，將其配制成菌液，然后用PSB 菌液來處理金桂插穗，結果提高了插穗的成活率和根系數量。在栽培土壤中添加濃度為109CFU·mL-1的PSB 菌液，這對金桂移栽苗的生長有著較大的促進作用，其根系數量也明顯地增多；但是，濃度為109CFU·mL-1的PSB 菌液對金桂插穗的生長卻有一定程度的抑制作用。可見，在金桂幼苗（包括插穗和移栽苗）生長的不同階段其所需PSB 的有效濃度不同。濃度為100 ～150 mg·L-1的外源激素ABT-1 和濃度為106CFU·mL-1的PSB 的協同作用能有效促進金桂插穗的成活和生根。

許多研究者認為，PSB 通過改善土壤磷元素的營養狀況而促進植物的生長；也有研究者認為，PSB 分泌的生長調節物質，促進了植物根系的生長，PSB 可能具有解磷和促進植物生長的雙重作用[20]。植物根際溶磷菌可以提高植物對土壤磷元素的利用效率，對根瘤菌的結瘤和固氮具有促進作用，還有分泌IAA 的特性[21]。PSB 分泌的植物激素能調節植物的生長發育，還能促使植物對各種營養元素的吸收[22]。

植物不定根的發生受多種因素的影響，而內源激素及外源激素在根原基的形成中起著關鍵作用[23]。在通常情況下，ABA 被認為是扦插生根的抑制劑，高濃度的內源激素GA 與ABA 會抑制不定根的形成[24]。測定結果表明，在栽培土壤中添加濃度為106CFU·mL-1的PSB 菌液后，能在一定程度上促進金桂根系的發育，且插穗中GA 與ABA 的含量始終保持在較低的水平上，這對其不定根的形成能起到一定程度的促進作用；而IAA是促進插穗生根、形成愈傷組織的主要內源激素，新根的生成促使金桂插穗體內合成IAA，以PSB菌液處理插穗后，其體內的IAA 含量從扦插初期直到試驗結束時始終保持在一個較高水準上，這一結果表明，適宜濃度的PSB 對金桂插穗中的激素水平具有較好的調節作用，能促使插穗合成更多的IAA，抑制ABA 與GA 的合成，從而促進插穗的生根發育。

俞新玲[25]將從桉樹根際土壤中提取出的PSB接種到桉樹苗木上，結果表明，不同處理的PSB菌株對桉樹生長均有一定的促進作用；王莉晶[26]分析了小麥根際土壤中的PSB 對小麥生長的影響情況，結果發現，PSB 的添加對小麥幼苗生長也有一定的促進作用，但是，濃度過高的PSB 反而會抑制小麥的生長，這一研究結果與本研究結果一致。根際PSB 除了對金桂插穗及移栽苗的生長都有促進作用之外，其對金桂的開花及其種子的形成是否也有作用，對此問題還需要進一步的調查與探究。

外源激素對插穗生根的影響途徑，可能不是直接改變某種內源激素的含量，而是通過促使各種內源激素之間達到一定程度的平衡，從而促進插穗生根的[27-28]；外源激素能影響微生物菌體的生長、發育與成熟。已有研究者報道，在豆科植物中，植物激素對根瘤菌的形成和發育起著調控作用[29]。研究發現，植物激素和PSB 的協同作用能夠促進植物生長，后期將深入探究其協同作用產生的機理。我國研究人員已從杉木等林木根際土壤中篩選和分離到多種具有高效解磷能力的優質菌株，并利用這些菌株開發出了生物有機肥，用于改善經濟林木所需磷素的養分狀況以促進林木的生長，這類生物有機肥具有較大的應用潛力[30]。

然而，本研究還未完成主要PSB 菌種的分子鑒定，接下來將對主要菌種進行鑒定。同時，將在金桂大田栽培生產中探索具體的PSB 的添加濃度和添加方法，為金桂解磷微生物的發現及其生物肥料的開發開展更加深入的研究，以期開發出更為高效的微生物菌肥。