番木瓜鎂離子轉運蛋白基因CpMGT1的克隆與功能分析

許迎港　鄒智　郭靜遠　孔華　朱國鵬　郭安平

摘? 要：鎂是一種大量金屬營養元素，其在植物的生長、發育、光合、脅迫響應等生物學過程中起重要作用。在高等植物中，Mg的吸收、運輸、分布和再分配主要由鎂離子轉運蛋白（MGT/MRS2）和Mg/H交換體（MHX）介導。其中，MGT/MRS2又名CorA，最先在鼠傷寒沙門氏菌中被發現，后在擬南芥、水稻等模式植物中進行了較為深入的研究。番木瓜（ L.）是一種隸屬于十字花目番木瓜科的重要熱帶果樹，至今還未見有關基因的報道。本研究基于番木瓜的基因組和轉錄組數據，采用RT-PCR技術成功克隆到一個基因（），應用生物信息學手段預測蛋白的理化特性和保守基序，運用qRT-PCR分析基因的表達模式，利用缺失CorA、MgtA和MgtB的沙門氏菌突變株MM281進行功能互補。結果表明：的編碼區為1332 bp，預測編碼443 aa，理論分子量為50.43 kDa、等電點為5.12;該蛋白含有2個疏水跨膜區（TM1和TM2），其中TM1包含高度保守的GMN基序;進化及亞細胞定位分析表明CpMGT1與擬南芥中AtMGT1和AtMGT2的親緣關系較近，定位于細胞膜;定量分析顯示基因為組成型表達，其中在根、莖和果實中的表達量較高;在MM281中異源表達可顯著提高工程菌在低Mg濃度下的生長速率，表明CpMGT1具有高效的Mg轉運活性。的克隆與鑒定為進一步揭示番木瓜基因在不同組織特別是在果實中Mg的積累機制奠定了堅實的基礎。

關鍵詞：番木瓜;鎂離子轉運蛋白;表達分析;沙門氏菌;功能互補中圖分類號：S59;S813.3 ?????文獻標識碼：A

Cloning and Functional Analysis of ， a Magnesium Transporter Gene from

XU YinggangZOU ZhiGUO JingyuanKONG HuaZHU GuopengGUO Anping

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Sanya Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya， Hainan 572024， China; 3. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions / Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Magnesium is a macronutrient that plays essential roles in plant growth， development， photosynthesis， stress response as well as other biological processes. In higher plants， it has been established that absorption， transport， distribution， and reallocation of Mg are mainly mediated by MGTs/MRS2s （magnesium transporters/mitochondrial RNA splicing2s） and MHXs （magnesium-proton exchangers）. Among them， the family MGT， also known as CorA （cobalt resistance A） that was originally identified in ， was most studied， especially in model plants such as arabidopsis （） and rice （）. By contrast， little information is available in papaya （L.）， an economically important tropical crop of the Caricaceae family within Brassicales. Based on mining accessible genome and transcriptome data of papaya， in this study， a magnesium transporter gene named ， which includes an open reading frame of 1332 bp， was successfully cloned using RT-PCR （reverse transcription polymerase chain reaction）. Furthermore， the protein physicochemical properties and conserved motifs were investigated using bioinformatics tools， the gene expression patterns were analyzed using qRT-PCR （quantitative real-time PCR）， and functional complementarity was performed through heterologous expression in mutant MM281 that lacks Mgtransporting systems （i.e. CorA， MgtA， and MgtB） and can’t grow on media containing low concentrations of Mg. Results showed that was predicted to encode 443 amino acids with a theoretical molecular weight of 50.43 kDa and an isoelectric point of 5.12; the protein was shown to contain two hydrophobic transmembrane regions （i.e. TM1 and TM2）， while TM1 harbored the highly conserved GMN motif; the subcellular localization prediction suggested that the CpMGT1 protein was located in the plasma membrane， whereas the evolutionary analysis revealed that it was closely related to AtMGT1 and AtMGT2， two high affinity Mg transporters in arabidopsis; the expression analysis showed that was constitutively expressed in tissues examined， with most abundance in roots， stems， and fruits; heterologous expression of in the MM281 mutant could significantly improve the growth of engineering strain at low Mg concentrations， implying its high Mgtransport activity. Taken together， this study presents the molecular cloning and characterization of the first gene in papaya， including sequence features， physicochemical properties， evolutionary relationships， gene expression patterns as well as Mgtransport activity. These results could not only lay a solid foundation for further uncovering the accumulation mechanism of Mg in different tissues especially in the fruit， but also provide a valuable resource for genetic improvement in papaya and other species.

; magnesium transporter; expression analysis; ; functional complementarity

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.003

Mg是生物體內廣泛存在的二價金屬陽離子，其在植物的各種生理生化過程中起重要作用。Mg具有較大的水合半徑、小的離子半徑和高的電荷密度，這些物理結構決定了其轉運蛋白的特異性。在高等植物中，Mg的轉運主要由鎂離子轉運蛋白（magnesium transporter/mit-o-c-hondrial RNA splicing 2， MGT/MRS2）和Mg/ H交換體（magnesium-proton exchanger， MHX）介導。其中，基因最早在鼠傷寒沙門氏菌（）中被發現，缺失Mg轉運系統（即CorA、MgtA和MgtB）的突變株MM281無法在低于10 mmol/L Mg的N-Minimal培養基上生長。至今MGT家族成員已在擬南芥（）、水稻（）等植物中進行了較為深入的研究。在擬南芥的10個中，有9個基因的編碼蛋白具有Mg轉運活性，其中，AtMGT1、AtMGT2和AtMGT10為高親和型，AtMGT3、AtMGT6、AtMGT7和AtMGT9為低親和型，AtMGT5為雙親和型;對、、等突變體的研究表明，其胞質中的Mg濃度明顯低于野生型。在水稻的9個家族成員中，的上調表達可明顯增加細胞中的Mg濃度，從而增強植株的耐鋁脅迫能力。結構分析顯示，MGT蛋白序列的C-末端通常含有兩個保守的疏水跨膜結構域（TM1和TM2）及位于TM1末端的三肽基序GMN（Gly-Met-Asn）。

番木瓜（ L.）是一種隸屬于十字花目番木瓜科的多年生常綠果樹，含多種維生素、氨基酸、鉀、鈣、鎂、鐵等，被譽為“水果之王”。本研究基于番木瓜的基因組和轉錄組數據，對一個果實高豐度表達基因進行克隆、生物信息學及表達模式分析，并在此基礎上利用沙門氏菌突變株MM281進行功能互補，以期為今后的遺傳改良奠定基礎。

? 材料與方法

?材料

1.1.1 ?植物材料? 供試番木瓜品系為中白，種植于中國熱帶農業科學院文昌試驗基地，樹齡為7個月。選取長勢基本一致的植株分成3組，每組3個單株，花授粉后即進行標記，最后于同一天早上8：00之前采集授粉后10、60、120?d的果實及根、莖、葉、花等其他組織，授粉后120?d的果實用報紙包裹后置于25℃培養室中，分別放置6?h、2?d和6?d，每樣品3次生物學重復，樣品采集后立即放入液氮中速凍，并置于–80℃保存備用。

1.1.2? 菌株及載體 ?大腸桿菌DH5α由本實驗室保存;沙門氏菌突變株MM281和質粒Trc99A由中國熱帶農業科學院橡膠研究所陽江華副研究員惠贈。

1.1.3? 主要試劑 ?反轉錄試劑盒PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit和高保真酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase購自寶日醫生物技術（北京）有限公司;膠回收試劑盒Gel Extraction Kit和質粒提取試劑盒Plasmid DNA Mini KitⅠ購自Omega Bio-Tek;各類限制性內切酶均購自美國NEB;重組克隆試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit購自諾唯贊;其余試劑均為國產分析純。

?方法

1.2.1 ?總RNA的提取及cDNA的合成? 總RNA的提取參照房平昌的方法，主要流程如下：取樣品2～3 g，在液氮下用研缽研磨成細粉末;加入10 mL 65℃預熱的CTAB提取液和200?mL β-巰基乙醇，渦旋劇烈混勻，65℃水浴5～20?min，中間振蕩數次;待冷卻到室溫后加入等體積的氯仿，振蕩混勻，4℃ 15?000′離心10?min;將上清液轉至另一新管中，并加入等體積的水飽和酚和氯仿，充分振蕩，4℃ 15?000′離心10?min（視情況重復上述步驟1～2次）;將上清吸出后，加入總體積1/3的8?mol/L LiCl，–20℃冰箱放置12?h，再次離心，取上清，75%乙醇洗滌沉淀2次，沉淀用50～100?mL DEPC水溶解。質檢合格后參照TAKARA反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，–20℃保存待用。

1.2.2? 基因克隆與載體構建 ?通過搜索番木瓜的基因組和轉錄組數據（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）獲得的全長轉錄本序列，并據此設計如表1所示的3對基因特異性引物。以不同組織混合來源的cDNA作為模板，采用巢式PCR法進行擴增，首輪反應體系為PrimeSTAR Max premix 2×12.5?μL、cDNA 1?μL、F/ R各1 μL、ddHO 10.5?μL;擴增程序為95℃預變性1?min，98℃變性10?s、53℃退火25?s、72℃延伸1.5?min（35個循環），最后72℃延伸5?min。PCR產物經電泳檢測后切膠回收，稀釋50倍作為第二輪PCR擴增的模板，反應體系為PrimeSTAR Max premix 2×50?μL、第一輪PCR產物為cDNA 1?μL;-99F/- 99R各1?μL、ddHO 22?μL;擴增程序為95℃預變性1?min，98℃變性11 s、54℃退火25 s、72℃延伸1.5?min（25個循環），最后72℃延伸5?min。表達載體Trc99A使用限制性核酸內切酶RⅠ（10 U/mL）和Ⅰ（10 U/mL）進行酶切，切膠回收后與第二輪PCR獲得的目的基因片段按1∶3比例混勻，并用同源重組酶Exnase II 37℃水浴連接2 h，然后采用凍融法轉入DH5α大腸桿菌感受態細胞，菌落PCR驗證后選取陽性克隆進行測序分析。

1.2.3? 生物信息學分析? 用在線軟件Expasy（https：//web.expasy.org）分析理論分子量和等電點;用NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析保守結構域;用在線軟件WoLF PSORT（https：//www.genscript. com/wolf-psort.html）分析亞細胞定位;用MEGA 6.0軟件中的MUSCLE進行序列比對，并用鄰接法構建進化樹。

1.2.4? 基因的表達分析? 參照鄒智等的方法進行熒光定量分析，內參基因為，引物信息詳見表1，使用2法計算基因的相對表達值，并用SPSS軟件進行顯著性差異分析。

1.2.5? 沙門氏菌功能互補分析? 利用化學轉化法將重組質粒Trc99A-轉入MM281感受態中，選取陽性單克隆搖菌，陽性對照為Trc99A- ，陰性對照為MM281突變株及轉Trc99A空載的MM281突變株。搖至0.6后，加入1/10 IPTG，將菌液繼續搖至1.0，并用N-Minimal培養基洗滌2～3次，分別稀釋到5個濃度梯度。準備4個不同Mg濃度的N-Minimal固體培養皿，將處理好的菌液呈梯度式點至培養皿，倒置培養2～3?d后，觀察長勢并拍照。

?結果與分析

基因克隆

如圖1所示，PCR擴增成功獲得1條約1300?bp的目的條帶，而Trc99A的雙酶切獲得1條約4100?bp的目的條帶，將其孵育后構建原核表達載體Trc99A-。

2.2? 生物信息學分析

序列分析表明，的編碼區（CDS）為1332?bp（NCBI登錄號為XM_022050807），預測編碼443 aa，理論分子量（MW）為50.43 kDa，等電點（pI）為5.12。CDD分析和序列比對顯示，CpMGT1含有保守的Mrs2_Mfm1p-like（cd12823）結構域;在C端含有2個疏水跨膜區（即TM1和TM2），且TM1包含高度保守的GMN基序（圖2）。WoLF PSORT分析顯示，CpMGT1定位在細胞膜。

2.3 ?進化分析

為揭示CpMGT1的進化特征，將其與已報道的擬南芥和水稻MGT蛋白構建進化樹（圖3）。結果表明，這些MGT被聚為5支，其中，CpMGT1與擬南芥的AtMGT1（NP_001322724）、AtMGT2（NP_001077545）、AtMGT3（NP_001118259），水稻的OsMRS2-1（XP_015643498）、OsMRS2-9（XP_015633967）聚在一起。相比而言，CpMGT1與AtMGT1和AtMGT2的相似性更高，分別為83.33%和86.04%。

2.4? 基因表達分析

表達分析顯示，在所分析的不同組織中均有表達，其中在根、莖和果實中的表達量相對較高（圖4A）。在果實中，隨著果實的發育呈現先降后升的趨勢，即在授粉后120 d時相對表達量最高;采后呈現先升后降的趨勢，即采后2 d相對表達量最高，但低于授粉后120 d（圖4B）。

2.5 ?功能互補分析

為鑒定的Mg轉運活性，將構建的重組質粒Trc99A-轉入MM281突變株中。功能互補實驗顯示，實驗組和對照組在10?mmol/L Mg的平板上均可正常生長。然而，當培養基中的Mg濃度降低到5?mmol/L時，陰性對照未見生長，而實驗組與陽性對照長勢相當。隨著Mg濃度的進一步降低，實驗組和陽性對照的生長雖然都呈現減弱趨勢，但是趨勢相當，這表明CpMGT1是與AtMGT1活性相當的高親和型Mg轉運蛋白（圖5）。

討論

植物的生長發育依賴于根系所吸收的礦質營養元素，這些元素需通過質外體和共質體途徑轉移到地上部組織中，這一過程不僅需要蒸騰作用的驅動，還需要各種離子通道和轉運體的運輸，其中包括Mg轉運蛋白。在植物中，Mg轉運蛋白由多個成員構成的基因家族編碼，如擬南芥中含有10個成員、水稻中有9個成員、玉米中有12個成員、甘蔗中有10個成員、香蕉中有10個成員、油菜中有36個成員。對擬南芥、水稻等模式植物的深入研究表明，MGT蛋白廣泛參與了Mg吸收、轉運及分區儲藏。

本研究首次報道了一個隸屬于基因家族的番木瓜Mg轉運蛋白基因，該基因編碼443?aa、分子量為50.43?kDa、等電點為5.12，細胞膜定位。更重要的是，蛋白含有該家族特有Mrs2_Mfm1p-like或CorA（PFAM登陸號PF01544）結構域及位于C端疏水跨膜區TM1上的GMN基序。早前的研究表明，GMN基序為Mg轉運所必需。根據基因表達分析結果，總體為一組成型表達基因，其中在根、莖和果實中的表達量較高，暗示該基因可能在多個部位發揮Mg轉運功能。根據進化分析結果，CpMGT1與擬南芥中AtMGT1和AtMGT2的親緣關系較近，相似性高達80%以上，這不僅暗示它們之間的直系同源關系及類似的生物學功能，同時，該結果跟番木瓜與擬南芥同屬十字花目的分類學關系是一致的。前人的研究結果表明，和均可互補沙門氏菌突變株MM281，且二者均編碼高親和型Mg轉運蛋白。AtMGT1定位于細胞質膜，具有較高的組織特異性，主要在根部和表皮中表達;基因表達受Al

誘導，其過量表達可增強轉基因植株對鋁毒的抗性。AtMGT2定位于液泡膜，主要在幼嫩葉片中發揮Mg轉運功能，并與AtMGT3共同維持葉肉細胞中液泡的Mg平衡。此外，有研究顯示，還能互補Mg轉運缺陷型酵母突變株CM66，并顯著提高酵母的生長效率。與進化結果相應的是，的異源過表達可互補MM281突變株，并顯著提高工程菌在低Mg濃度下的生長速率，這初步證實編碼一個高親和的Mg轉運蛋白，且其活性與AtMGT1相當。雖然如此，具體是如何調控Mg平衡的分子機制還有待深入研究。

綜上，本研究完成了番木瓜基因的克隆及序列特征、進化關系、表達模式和Mg轉運活性分析。這些結果不僅為進一步揭示番木瓜基因在不同組織特別是在果實中Mg的積累機制奠定了堅實的基礎，也為今后的品種改良提供了寶貴的資源。

參考文獻

1. 郭照輝， 張德元， 毛丹丹， 李詠梅. 植物Mg轉運蛋白與相關基因及其功能的研究進展[J]. 生命科學研究， 2008， 12（3）： 4.GUO Z H， ZHANG D Y， MAO D D， LI Y M. Progress on the function of magnesium transport proteins and genes in plant[J]. Life Science Research， 2008， 12（3）： 4. （in Chinese）
2. 張? 崗， 翟清華， 張大為， 胡本祥， 郭順星. 鐵皮石斛鎂離子轉運蛋白基因的克隆及表達分析[J]. 中草藥， 2014， 45（23）： 3443-3448.ZHANG G， ZHAI Q H， ZHANG D W， HU B X， GUO S X. Cloning and expression analysis of a magnesium transporter gene in [J]. Chinese Herbal Medicine， 2014， 45（23）： 3443-3448. （in Chinese）
3. SZEGEDY M A， MAGUIRE M E. The CorA Mg transport protein of [J]. Journal of Biological Chemistry， 1999， 274（52）： 36973-36979.
4. PAPP-WALLACE K M， NARTEA M， KEHRES D G， PORWOLLIK S， MCCLELLAND M， LIBBY S J， FANG F C， MAGUIRE M E. The CorA Mg channel is required for the virulence of serovar Typhimurium[J]. Journal of Bacteriology， 2008， 190（19）： 6517-6523.
5. 叢悅璽. 擬南芥鎂脅迫突變體篩選及鎂毒害響應機制初探[D]. 杭州： 浙江大學， 2012.CONG Y X. Screening of magnesium stress mutants and the mechanism of the plant responding to magnesium toxicity in [D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2012. （in Chinese）
6. SAITO T， KOBAYASHI N I， TANOI K， IWATA N， SUZUKI H， IWATA R， NAKANISHI T M. Expression and functional analysis of the CorA-MRS2-ALR-Type magnesium transporter family in rice[J]. Plant and Cell Physiology， 2013， 54（10）： 1673-1683.
7. 趙智芳. 梨鎂離子轉運體家族分析及的功能驗證[D]. 南京： 南京農業大學， 2016.ZHAO Z F. Family analysis of magnesium transporter in pear and functional verification of [D]. Nanjing： Nanjing Agricultural College， 2016. （in Chinese）
8. CONN S J， CONN V， TERMAN S D， KAISER B N， LEIGH R A， GILLIHAM M. Magnesium transporters， MGT2/ MRS2-1 and MGT3/MRS2-5， are important for magnesium partitioning within mesophyll vacuoles[J]. New Phytologist， 2011， 190（3）： 583-594.
9. 房平昌. 橡膠樹己糖激酶在膠乳再生中基因鑒定及功能分析[D]. 綿陽： 西南科技大學， 2021.FANG P C. Gene identification and functional analysis of hexokinase involoving in the latex regeneration of [D]. Mianyang： Southwest University of Science and Technology， 2021. （in Chinese）
10. 鄒? 智， 郭運玲， 孔? 華. 橡膠樹葉片衰老相關基因的克隆與表達分析[J]. 西南林業大學學報（自然科學）， 2021， 41（4）： 42-48.ZOU Z， GUO Y L， KONG H. Cloning and expression analysis of ， a gene associated with leaf senescence in rubber tree （ Muell. Arg.）[J]. Journal of Southwest Forestry University （Natural Science）， 2021， 41（4）： 42-48. （in Chinese）
11. DAVID-ASSAEL O， SAUL H， SAUL V， MIZRACHY- DAGRI T， BEREZIN I， BROOK E， SHAUL O. Expression of ， an vacuolar metal transporter， is repressed by the 5' untranslated region of its gene[J]. Journal of Experimental Botany， 2005， 56（413）： 1039-1047.
12. LI L， TUTONE A F， DRUMMOND R S， GARDNER R C， LUAN S. A novel family of magnesium transport genes in [J]. The Plant Cell， 2001， 13（12）： 2761-2775.
13. WHITEMAN S A， SERAZETDINOVA L， JONES A M， SANDERS D， RATHJEN J， PECK S C， MAATHUIS F J. Identification of novel proteins and phosphorylation sites in a tonoplast enriched membrane fraction of [J]. Proteomics， 2008， 8（17）： 3536-3547.
14. 鄧沛怡， 田連福， 陳? 鍵， 欒? 升， 李東屏. 擬南芥基因轉運功能研究[J]. 生命科學研究， 2007（4）： 328-333.DENG P Y， TIAN L F， CHEN J， LUAN S， LI D P. The functional analysis of ， a member of putative Mg transporter family in [J]. Life Science Research， 2007（4）： 328-333. （in Chinese）
15. MAO D D， TIAN L F， LI L G， CHEN J， DENG P Y， LI D P， LUAN S. ： An gene encoding a low-affinity magnesium transporter[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2008， 50（12）： 1530-1538.
16. CHEN Z C， YAMAJI N， MOTOYAMA R， NAGAMURA Y， MA J F. Up-regulation of a magnesium transporter gene is required for conferring aluminum tolerance in rice[J]. Plant Physiology， 2012， 159（4）： 1624-1633.
17. ZHANG L， WEN A， WU X， PAN X， WU N， CHEN X， CHEN Y， MAO D， CHEN L， LUAN S. Molecular identification of the magnesium transport gene family in [J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2019（136）： 204-214.
18. BOSE J， BABOURINA O， SHABALA S， RENGEL Z. Low-pH and aluminum resistance in correlates with high cytosolic magnesium content and increased magnesium uptake by plant roots[J]. Plant and Cell Physiology， 2013， 54（7）： 1093-1104.
19. DENG W， LUO K， LI D， ZHENG X， WEI X， SMITH W， THAMMINA C， LU L， LI Y， PEI Y. Overexpression of an magnesium transport gene， ， in confers Al tolerance[J]. Journal of Experimental Botany， 2006， 57（15）： 4235-4243.