Bach2對Th2細胞內IL-33生物學功能的影響①

劉 果 于凌昱 馬騰飛 劉 鋒 （四川大學華西醫院耳鼻咽喉頭頸外科，成都 610041）

輔助型T 細胞2（T helper 2 cell，Th2）是CD4+T細胞的效應細胞，以表達轉錄因子Gata3和分泌Th2型細胞因子（IL-4、IL-5 和IL-13 等）為特征，其主要功能為參與并調節2 型免疫應答［1-2］。正常情況下，2 型免疫應答有助于機體抵抗外界致病菌入侵；但在特殊因素誘導下，Th2 細胞功能亢進，分泌過多細胞因子，可導致Th2 型炎癥疾病，如哮喘、變應性鼻炎和特異性皮炎等［1，3］。

IL-33 是一種與Th2 型炎癥反應密切相關的細胞因子，屬于IL-1 家族成員，其受體ST2 表達于Th2細胞表面［4］。研究發現，IL-33 不僅可誘導Th2 細胞上調ST2表達，同時，IL-33結合ST2后將激活Th2細胞內NF-κB 和MAPK 信號通路，導致細胞因子IL-5和IL-13 大量釋放［5-6］。因此，拮抗Th2 細胞內IL-33的生物學功能將有助于Th2型炎癥疾病治療［4］。

Bach2（bric-a-brac，tramtrack and cap'n' collar homology 2，Bach2）是T 細胞中最新發現的一種負性轉錄因子，具有強大的轉錄抑制能力［7-8］。近年研究發現，敲除Bach2基因后，小鼠肺部將產生Th2 型炎癥反應；CD4+T 細胞和Treg 將自發向Th2 細胞轉化；若轉染過表達Bach2將抑制此過程［9-10］。表明Bach2是Th2細胞分化過程中的關鍵負性調控因子。

Bach2 抑制Th2 細胞分化的機制是競爭性抑制MAPK 信 號 通 路［9］。而MAPK 信 號 通 路 同 樣 也 是IL-33的主要功能通路［5］。那么Bach2表達或缺失是否影響IL-33在Th2細胞內的生物學功能？同時，研究還發現敲除Bach2基因后，ST2將在Bach2-/-Th2細胞表面持續表達［10］。提示Bach2 可能與Th2 細胞內IL-33 信號通路有關。因此，本研究首先建立Bach2基因的條件敲除小鼠，再通過體內體外實驗探討Bach2 與Th2 細胞內IL-33 生物學功能的關系，為尋求新的治療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物Bach2-floxed 小鼠和Cd4-Cre 小鼠購于江蘇集萃藥康生物技術有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2018-0008；兩種轉基因小鼠雜交得到陽性條件敲除小鼠，即Bach2flox/floxCd4-Cre 小鼠（Bach2-CKO小鼠）和陰性Bach2flox/floxCd4小鼠（WT小鼠）。以上所有基因小鼠均以C57BL/6小鼠為背景，并飼養于四川大學華西醫院科技園SPF 級動物房，6～8 周齡時進行實驗。動物實驗方案及飼養使用經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準（2018183A）。

1.1.2 試劑和抗體 IL-2（cat#575402）、IL-4（cat#574302）、anti-CD3ε（cat#100339）、anti-CD28（cat#102115）、anti-IFN-γ（cat#505834）、FITC-anti-mouse CD4（cat#100405）、PE-anti-mouseCD62L（cat#104407）、PE-anti-mouse ST2（cat#146607）購于美國Biolegend公司；IL-33（cat#3626-ML/CF）、Mouse IL-5（cat#DY405）和IL-13（cat#DY413）DuoSet ELISA Kit 購 于 美 國R&D 公 司；anti-Bach2 mAb（cat#PA5-100792）和anti-Gata3 mAb（cat#14-9966-82）購于美國Invitrogen公司；EasySepTMMouse CD4+CD62L+T Cell Isolation Kit（cat#18765）購于加拿大Stemcell 公司；TRIzolTMReagent（cat#15596026）購 于 美 國Thermo 公 司；iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit（cat#1725035）和iTaqTMUniversalSYBRGreenSupermix（cat#1725120）購于美國Biorad 公司；HE（cat#G1120）、AB-PAS（cat#G1285）和瑞氏-吉姆薩（cat#G1040）染色試劑購于北京索萊寶公司；polybrene（cat#TR-1003）購于美國Sigma 公司；RPMI1640 細胞培養基（cat#11875）和胎牛血清（cat#10100147）購于美國Gibco 公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（cat#P0010）和ECL發光液（cat#P0018AS）購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構建 IL-33經鼻滴藥建立小鼠呼吸 道Th2 型 炎 癥 模 型［11-12］，并 分 為 實 驗 組（6 只Bach2-CKO 小鼠）和對照組（6 只WT 小鼠）：于小鼠腹股溝連線中點至臍部連線中外1/3 處注射IL-33（4 μg/d），再將IL-33（1 μg/d）溶于PBS（50 μl），雙側交替緩慢滴入鼻腔，連續4 d，最后1 次給藥24 h 后處死所有小鼠。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗及肺組織病理學檢查 處死小鼠，隨機選取6 只小鼠（實驗組和對照組各3只）氣管內插入塑料管，PBS灌洗（1 ml/次），反復吹吸后回收，重復3次。收集支氣管肺泡灌洗液（bron?choalveolar lavage fluid，BALF）離心（4 ℃、2 000 r/min，5 min），棄上清，重懸，計數器檢測細胞總數。BALF沉淀細胞制備細胞涂片，行瑞氏-吉姆薩染色，鏡下分類計數，計算BALF 沉淀細胞種類和百分率以及絕對細胞數。剩余6 只小鼠（實驗組和對照組各3 只）處死后直接取左肺組織固定于10%甲醛緩沖液，組織切片后行HE 和AB-PAS 染色，觀察肺組織結構變化；取右肺組織提取總RNA行RT-PCR檢測。

1.2.3 細胞分離提取及誘導分化 取小鼠脾臟制備細胞懸液，按照EasySepTMMouse CD4+CD62L+T Cell Isolation Kit 說明書分離得到na?ve CD4+T 細胞。將分離的CD4+T 細胞加入包被處理好的24 孔板內培養。抗體包被孔板方法：500 μl/孔PBS 內含anti-CD3ε（5 μg/ml）和anti-CD28（10 μg/ml）包被孔板，4 ℃孵育過夜［13］。Th2 細胞刺激誘導分化條件：IL-2（10 ng/ml）、IL-4（10 ng/ml）和anti-IFN-γ mAb（5 μg/ml）刺激4 d［13］；IL-33刺激條件：IL-33（10 ng/ml）聯合IL-2（10 ng/ml）刺激培養。

1.2.4 流式細胞術檢測CD4+T 細胞純度及膜受體ST2 表達 磁珠分選細胞后，立即取部分細胞進行FITC-anti-CD4 和PE-anti-CD62L 細胞膜表面染色，流式細胞儀分析細胞提取純度。剩余細胞以1×106個/孔加入24孔板內培養2 d，Th2細胞誘導分化條件下培養3輪（4 d/輪）；收集細胞，進行細胞膜表面PE-anti-ST2 染色。所有染色細胞采用Beckman-cytoflex 流式細胞儀檢測，FlowJo軟件分析數據。

1.2.5 ELISA檢測細胞上清中Th2型細胞因子分泌水平 IL-33 主要誘導Th2 細胞釋放IL-5 和IL-13，而不影響IL-4表達［5，14］，因此，納入IL-5和IL-13作為判定指標。IL-33 刺激細胞后不同時間點（0 h、3 h、6 h、9 h）收集上清，嚴格按照Mouse IL-5 和IL-13 DuoSet ELISA Kit說明書操作。酶標儀于波長450 nm處測定吸光度，參照試劑盒提供的標準品繪制標準曲線并計算IL-5、IL-13濃度。

1.2.6 RT-PCR 檢測肺組織及細胞內Th2型細胞因子mRNA 表達 TRIzol法提取小鼠右肺組織及細胞總RNA，并按照iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit 說明書逆轉錄合成cDNA。以cDNA 為模板、18S為 內 參，RT-PCR 檢 測IL-4、IL-5、IL-13及Bach2mRNA表達，引物序列見表1。

1.2.7 腺病毒轉染細胞 委托上海吉凱基因科技有限公司構建含有mouseBach2-cDNA 的腺病毒載體；將分離得到的Bach2-/-CD4+T 細胞按1×106個/孔加入包被處理好的24 孔板，并在Th2 條件下誘導分化4 d；加入腺病毒和polybrene，1 000 g 室溫離心，感染90 min后37 ℃孵化24 h；第2天，將新鮮培養基加入細胞中，并繼續在Th2條件下培養2 d進行相關實驗。

1.2.8 Western blot 檢 測Bach2、Gata3 蛋 白 表 達提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度；凝膠電泳分離等量蛋白后上樣、轉膜、封閉，加入一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜；Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌后將膜與適當稀釋的二抗室溫孵育2 h，滴加ECL 發光液，凝膠成像儀觀察結果。

1.3 統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示。兩組間均數比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-33 加重Bach2-CKO 小鼠呼吸道Th2 型炎癥反應

2.1.1 病理結果 兩組小鼠肺組織、支氣管周圍均見大量單核炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜內杯狀細胞化生、黏液腺分泌增加；與對照組相比，實驗組小鼠肺組織內炎癥細胞浸潤程度更重（成團分布）、支氣管黏膜內杯狀細胞化生更加明顯、黏液腺分泌亢進（圖1A）。

2.1.2 支氣管肺泡灌洗 實驗組BALF 中細胞總數較對照組明顯增加，以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞增多為主（P<0.05，圖1B）。

2.1.3 肺部RT-PCR 結果 與對照組相比，IL-33顯著增加實驗組小鼠肺組織內IL-4、IL-5和IL-13mRNA 表達（P<0.05，圖1C）。表明在CD4+T 細胞缺失Bach2 調控的基礎上，IL-33 進一步加重小鼠呼吸道Th2型炎癥反應。

圖1 IL-33 加重Bach2-CKO 小鼠呼吸道Th2 型炎癥反應（×50）Fig.1 IL-33 aggravated Th2-type airway inflammation of Bach2-CKO mice（×50）

2.2 Bach2 缺失對Th2 細胞內IL-33 生物學功能的影響

2.2.1 細胞分選純度及誘導分化結果 磁珠分選后得到較高純度na?ve CD4+T 細胞（約90.6%，圖2A）；Bach2mRNA 高表達于CD4+T 細胞，而在Bach2-/-CD4+T 細胞內幾乎無表達（圖2B），提示Bach2基因敲除成功；膜受體ST2 在誘導分化后的細胞表面高表達（圖2C），提示Th2細胞誘導分化成功。

2.2.2 Bach2缺失對IL-33生物學功能的影響 IL-33可增加兩種Th2 細胞內IL-5、IL-13mRNA 表達以及細胞外IL-5、IL-13 釋放；與正常Th2 細胞組相比，IL-33顯著促進Bach2-/-Th2細胞表達IL-5和IL-13（圖2D、E）。表明Th2 細胞內缺失Bach2 調控，可促進IL-33生物學功能，增加Th2型細胞因子表達。

圖2 Bach2缺失對Th2細胞內IL-33生物學功能的影響Fig.2 Effect of Bach2 deficiency on biological function of IL-33 in Th2 cells

2.3 Bach2 過表達對Th2 細胞內IL-33 生物學功能的影響

2.3.1 Bach2 過表達對IL-33 生物學功能的影響Bach2-/-Th2 細胞內轉染過表達Bach2-cDNA 使其成為Bach2-expressed Th2細胞（Bach2-ex Th2，圖3A）。加入IL-33 培養刺激（轉染后72 h）。與Bach2-/-Th2細胞相比，Bach2-ex Th2 細胞內IL-5、IL-13mRNA 表達明顯下調，細胞外釋放量明顯減少（圖3B、C），提示Bach2 過表達將有效抑制IL-33 誘導Th2 細胞釋放細胞因子。

2.3.2 Bach2過表達對Th2細胞的影響 轉染后不同時點（0 h、48 h和72 h）檢測Th2細胞生物學特性，發現隨著Bach2-cDNA不斷表達，Bach2-/-Th2細胞內Gata3蛋白激酶水平逐漸下降（圖3A）；細胞表面ST2受體表達逐漸下調（圖3D）；說明Bach2 過表達抑制Th2細胞生物學特性。

圖3 Bach2過表達對Th2細胞及IL-33生物學功能的影響Fig.3 Effects of up-regulation of Bach2 on biological function of IL-33 in Th2 cells

3 討論

Bach2 是Bach 家族中一種負性轉錄因子，由1 個堿性亮氨酸拉鏈結構域和相鄰保守的Cap'n'collar 結構域組成，具有強大的轉錄抑制能力［15］。Bach2 通常與sMaf 蛋白結合形成異源二聚體，識 別 含 有TGCTGA（G/C）TCA（T/C）序 列 的MARE（Maf-recognition elements）元件，進而抑制靶基因轉錄和表達［8，15］。

研 究 顯 示，Bach2 高 表 達 于B 細 胞、CD4+T、CD8+T細胞、肺泡巨噬細胞和神經元細胞［15］。CD4+T細胞系中，Bach2 的主要功能是維持T 細胞原始性，抑制其向Th2細胞分化［8，15］。TSUKUMO等［10］研究發現，Bach2 高表達于正常的na?ve CD4+T 細胞和Treg，而在Th2 細胞內表達明顯降低。敲除Bach2基因，na?ve CD4+T 和Treg 將 自 發 向Th2 細 胞 分 化；Bach2-/-na?ve CD4+T 細胞內Th2 相關基因表達上調；而 細 胞 表 面 將 高 表 達IL-33 受 體ST2［10，16］。同 樣，KUWAHARA 等［9］通過Bach2基因敲除小鼠模型發現，T 細胞內缺乏Bach2 調控將導致小鼠肺部自發Th2 型炎癥反應。與此同時，肺組織內IL-33mRNA及受體ST2 表達明顯增加；提示Bach2 可能與IL-33/ST2信號通路有關。

本研究首先建立Bach2基因的條件敲除小鼠，經鼻給予IL-33誘發呼吸道Th2型免疫應答，發現與正常小鼠相比，IL-33顯著加重Bach2-CKO小鼠肺組織內淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，促進杯狀細胞化生和黏液腺分泌以及Th2 型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13表達，說明Bach2在體內參與IL-33相關Th2型炎癥反應調控。體外實驗發現，與正常Th2 細胞相比，IL-33顯著促進Bach2-/-Th2細胞釋放細胞因子IL-5 和IL-13；而在Bach2-/-Th2 細胞內轉染過表達Bach2 將有效抑制IL-33 相關細胞因子表達與釋放。證明Bach2 參與Th2 細胞內IL-33/ST2 信號通路調控，且能有效抑制細胞內IL-33生物學功能。

Bach2 抑制IL-33 生物學功能的機制尚未闡明，推測有以下兩種可能：①IL-33 受體ST2 在Bach2-/-Th2細胞表面高表達，而在Bach2過表達的Th2細胞內明顯受抑制。ST2 表達下調將直接影響細胞內IL-33 信號通路激活。因此，課題組認為Bach2 首先可通過影響Th2 細胞表面受體ST2 表達進而調控IL-33/ST2 信號通路；②研究證實，IL-33 主要通過激活Th2 細胞內p38-MAPK 信號通路促進細胞因子釋放［14，17］；同時，KUWAHARA 等［9］研究發現，Th2 細胞內Bach2 可與轉錄因子Batf 結合形成Bach2-Batf 異源二聚體，競爭抑制MAPK 信號通路。因此，Th2 細胞內Bach2 是否通過直接調控MAPK 信號通路進而抑制IL-33 生物學功能尚不清楚，這將是課題組下一步研究方向。

綜上所述，本研究證明Bach2 參與了Th2 細胞內IL-33/ST2 信號通路調控，可有效抑制該細胞內IL-33生物學功能。