HIV-1感染者病毒學指標與血漿中白細胞介素表達水平的相關性研究①

畢銘轅 李建輝 康 文 孫永濤 （中國人民解放軍空醫軍醫大學第二附屬醫院傳染病科，西安 710038）

白細胞介素（interleukin，IL）是由多種細胞產生，參與體內免疫調節、免疫應答、免疫激活、信息傳遞等多種過程的一類細胞因子［1］。由于IL作用廣泛，IL 家族根據其主要性質分為IL-1、IL-2、趨化因子、IL-10、IL-12及IL-17等。IL家族中與HIV-1感染及感染后患者免疫炎癥激活狀態相關的因子較多，包括主要為促炎癥因子的IL-1 家族中的IL-1β、IL-6和IL-18［2-4］；具有趨化作用的IL-8［5］；主要發揮免疫調節作用的IL-10家族中的IL-10、IL-16等［6-7］。盡管已有研究表明HIV-1 感染后，患者體內這些IL 表達會有一定改變，但其在血漿中的表達與未治療HIV-1感染者的病毒學水平，尤其是與HIV-1 DNA 水平是否相關鮮有報道。本研究根據HIV-1 RNA 或HIV-1 DNA 水平對HIV-1 感染者進行分組，觀察不同組間IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 表達差異，并分析其與HIV-1 RNA及HIV-1 DNA的相關性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取空軍軍醫大學第二附屬醫院就診的HIV-1 感染者75 例，所有HIV-1 感染者均經初篩和HIV-1抗體確認試驗，無HBV/HCV 合并感染或腫瘤，一般狀況良好，采血前均未接受過任何抗病毒治療。本研究經空軍軍醫大學第二附屬醫院倫理委員會批準（201911-04），患者血液樣本僅用于科研，75例患者一般資料及部分檢測結果見表1。

表1 未治療HIV患者基本信息Tab.1 Basic information of untreated patients with HIV

1.1.2 主要試劑與儀器 QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）；HIV-1 核酸檢測試劑盒、DNA 定量檢測試劑盒（廣州海力特）；CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP 熒光單克隆抗體試劑盒（同生時代）；Luminex Assay Human Premixed Multi-Analyte 試劑盒（R&D公司）；FACSAria Ⅱ流式細胞儀（BD公司）；

1.2 方法

1.2.1 PBMC 中DNA 提取 抽取受試者EDTA 抗凝的外周血10 ml用于PBMC 分離、流式細胞檢測和病毒核酸定量檢測。采用密度梯度離心法分離得到PBMC，用于后續檢測。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取PBMC樣本總DNA，嚴格按照試劑盒說明書進行，采用50 μl buffer AE 洗脫DNA 并保存于滅菌的200 μl EP 管。采用ScanDrop 儀檢測提取的DNA 核濃度，直接進行HIV-1 DNA 定量檢測或-20 ℃凍存。

1.2.2 HIV-1 RNA 定量檢測 采用HIV-1 核酸檢測試劑盒，在ABI 7500 熒光PCR 儀上對血漿樣本中HIV-1 RNA 進行定量檢測，嚴格按照試劑盒說明操作，結果以U/ml表示，最低檢測限為20 U/ml。

1.2.3 HIV-1 DNA 定量檢測 采用HIV-1 DNA 定量檢測試劑盒，在ABI 7500 熒光PCR 儀上對PBMC樣本中提取的HIV-1 DNA 進行定量檢測，嚴格按照試劑盒說明操作，結果以copies/106cells 表示，最低檢測限為20 copies/106cells。

1.2.4 外周血CD4+T 細胞、CD8+T 細胞計數 采用CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP 熒光單克隆抗體試劑盒和BD FACSAria Ⅱ流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞、CD8+T 細胞數，取50 μl 全血，采用20 μl 單克隆混合抗體混合物孵育20 min，紅細胞裂解液裂解紅細胞，上機檢測，結果采用Flowjo軟件進行分析。

1.2.5 Luminex 液相芯片檢測趨化因子 選取IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18并訂制對應的Luminex Assay Human Premixed Multi-Analyte Kit 試劑盒。取50 μl 血漿樣本并嚴格按照說明書操作，Luminex 200儀檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS23.0 軟件和Graph Pad Prism 8 軟件進行統計學處理、分析及繪圖。一般資料采用描述性分析，計量資料以±s表示。組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，兩兩比較采用q檢驗。由于HIV-1 DNA 及HIV-1 RNA 分布差異較大，取對數后進行相關性分析。相關性分析采用散點圖及Pearson 相關分析。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組病毒學水平及外周血CD4+T 細胞、CD8+T細胞計數比較 根據患者HIV-1 DNA是否<103copies/106cells 或HIV-1 RNA 是 否<106 U/ml 分 為4 組：DNA 高水平組（DHG）、DNA 低水平組（DLG）、RNA高水平組（RHG）和RNA 低水平組（RLG），各組患者一般資料、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞計數和CD4+/CD8+差異均無統計學意義（P>0.05，表2、表3）。

表2 HIV-1 DNA高、低組間差異Tab.2 Differences between high and low HIV-1 DNA groups

表3 HIV-1 RNA高、低組間差異Tab.3 Differences between high and low HIV-1 RNA groups

2.2 各組IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 表達比較 根據以上分組方法，對DLG 與DHG、RLG與RHG 組患者IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18表達進行比較，結果表明IL-8 表達在兩種分組方法下差異均無統計學意義（P>0.05），DHG 組與DLG組IL-1β 水平差異無統計學意義（P>0.05），而IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達差異均有統計學意義（P<0.05，圖1）。

圖1 各組IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18表達Fig.1 Expressions of IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-16 and IL-18 in each group

2.3 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 與病毒學指標相關性分析 上述結果表明不同HIV-1 RNA或HIV-1 DNA 水平組間趨化因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16和IL-18表達存在差異。進一步相關性分析表明，IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達與lgDNA 相關（r=-0.420、0.271、-0.332 和0.294，P<0.05），IL-1β和IL-8表達則與lgDNA 無關（r=-0.121和0.123，P>0.05）。同時，IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達與lgRNA 相關（r=-0.298、-0.462、0.299、-0.229 和0.269，P<0.05），而IL-8 表 達 與lgRNA 無 關（r=0.123，P>0.05，圖2）。

圖2 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18表達與病毒學指標相關性Fig.2 Correlation between expressions of IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-16 and IL-18 and virological indicators

3 討論

IL-1β 是一種重要的炎癥細胞因子，主要由外周血單核細胞和巨噬細胞分泌產生，與細胞凋亡密切相關［8］。炎癥、感染等刺激往往會誘導IL-1β水平升高，如HIV-1感染者腸道相關淋巴組織中IL-1β基因表達較健康人明顯增高［2］。但也有研究表明，IL-1β在體外可抑制淋巴細胞系、Jurkat 細胞和分離的PBMC 中HIV-1 復制，且可能通過阻斷caspase-3 表達和激活進而抑制病毒復制［4，9］。

IL-6 為促炎細胞因子，參與調節多種生理學過程，尤其是在急性炎癥反應和從急性炎癥向慢性炎癥轉變中起關鍵作用［10］。長期以來，HIV-1 感染已被證明可誘導單核細胞和巨噬細胞表達和分泌IL-6，即使在病毒學抑制情況下，接受治療的HIV 感染者血漿IL-6 水平也明顯高于匹配良好的未感染對照組［11-12］。最近研究表明，HIV-1感染者血漿IL-6水平升高與貧血、心血管疾病、癌癥等不良臨床結果相關［13-15］。IL-6 水平持續升高證明活動性炎癥可能對HIV-1 感染者預后具有重要臨床意義，但其是否參與并影響病毒復制過程尚無定論［3］。

IL-10 被認為是可由多種類型免疫細胞產生的Th2 型細胞因子，具有間接抑制Th1 反應的功能。研究表明，HIV-1、HBV、HCV 等多種病毒導致的慢性感染狀態下，IL-10 表現出對T 細胞的持續抑制作用，進而促進病毒感染活性［16］。IL-10可直接作用于抗原提呈細胞，減少刺激分子表達，阻止初始T細胞成熟，或直接作用于T 細胞以限制其增殖、功能分化［6］。HIV 感染者PBMC 產生的IL-10 可抑制CD4+和CD8+T細胞增殖及細胞因子產生，而阻斷IL-10可有效地在體外恢復這些細胞的功能［17］。

IL-16是一種淋巴細胞趨化因子，作為CD4的天然可溶性配體，具有促炎和免疫調節特性，對CD4+T細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞也具有趨化作用［7］。IL-16 的抗病毒活性最初是在分離培養的CD8+T 細胞中發現的，可抑制HIV-1和SIV復制［18］。盡管IL-16和HIV-1 均以CD4 為受體，但研究表明其并不共享共同結合位點［19］。因此，IL-16作為一種內源性抗病毒因子，在抑制HIV-1復制過程中發揮重要作用。

IL-18是一種促炎癥、促凋亡和致動脈粥樣硬化的細胞因子，屬于IL-1 細胞因子家族，關于其對HIV-1復制的影響一直頗有爭議。有研究認為IL-18通過誘導嗜堿性粒細胞和肥大細胞產生IL-4、IL-5等Th2 型細胞因子，促進初始CD4+T 細胞發育和分化為Th2 效應細胞，從而抑制抗HIV-1 的免疫作用，間接促進HIV-1 復制［20］。也有研究認為IL-18 通過介導IFN-γ 產生及上調SAMHD1 表達限制HIV-1 在初始巨噬細胞中的復制，或通過抑制caspase-3 激活和表達抑制HIV-1復制［4，21］。

本研究通過對75例未治療HIV患者血漿IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 水平進行檢測，并根據患者HIV-1 RNA 或HIV-1 DNA 水平進行分組，比較組間各IL 水平，結果表明除病毒學指標有差異外，組間患者一般情況及免疫學指標，如CD4+T 細胞、CD8+T 細胞計數和CD4+/CD8+差異均無統計學意義（P均>0.05），患者免疫學背景相似。相對于低病毒載量患者，高病毒載量患者血漿IL-10 和IL-18 表達升高，IL-1β、IL-6和IL-16表達降低，而兩組間IL-8表達差異無統計學意義。相關性分析也表明IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達與病毒載量相關，與既往研究提出的IL與HIV-1感染程度相關的結論一致［2-7］。此外，高HIV-1 DNA 患者血漿IL-10 和IL-18表達高于低HIV-1 DNA患者，IL-6和IL-16表達則低于低HIV-1 DNA 患者，而IL-1β 和IL-8 水平差異無統計學意義。相關性分析結果也表明IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達與HIV-1 DNA 相關。由 于HIV-1 DNA 被認為是衡量患者病毒儲存庫大小的重要指標，因此本研究認為IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達不僅與病毒載量有關，還可能與病毒儲存庫規模有關。由此可知，IL在HIV-1感染中扮演重要角色，是否有其他IL亞族因子也與HIV-1病毒儲存庫規模相關，以及這些趨化因子可能影響病毒儲存庫的具體機制有待進一步探索。