氯化兩面針堿調(diào)節(jié)AKT/ERK1/2 磷酸化影響肺癌細胞生長、運動、微管形成以及免疫應答①

張建新 劉雨露 朱子貴 趙 紅 姚平波 （南華大學附屬南華醫(yī)院胸外科，衡陽 421002）

肺癌是癌癥相關死亡的最常見原因之一，約占所有癌癥病死人數(shù)的25%。其中非小細胞肺癌約占所有肺癌病例的85%［1］。由于非小細胞肺癌早期癥狀不明顯及現(xiàn)有檢測方法的局限性，多數(shù)肺癌患者直到中晚期才能得到確診［2］。肺癌治療方法取決于癌癥的亞型和所在階段。肺癌已經(jīng)成為實體腫瘤分子靶向療法成功的典范，但免疫療法的高經(jīng)濟負擔、治療失敗率和治療性副作用促使人們尋找新的治療策略［3］。氯化兩面針堿（nitidine chloride，NC）是一種天然的生物活性植物化學生物堿，提取自蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根［4］。研究發(fā)現(xiàn)NC在多種類型的癌癥中均表現(xiàn)出抗癌活性，如肝癌、鼻咽癌、口腔鱗癌等［5-7］。但尚無證據(jù)表明NC 對肺癌細胞生物學特性的影響。本研究旨在探討NC 對肺癌細胞生長、運動、微管形成及免疫應答的影響，并闡明其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌細胞系A549 和NCI-H661 細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，Manassas，VA）；12周齡雄性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0031；F12 Kaighn 培養(yǎng)基、RPMI1640 培養(yǎng)基購自Invitrogen；NC（純度≥98%，CAS：13063-04-2）購自上海源葉生物科技有限公司；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、TNF-α、IL-10 和IL-4 試劑盒購自R＆D Sys?tems Co.，Ltd.（美國明尼蘇達州明尼阿波利斯）；所有抗體和內(nèi)參GAPDH 均購自Abcam 公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自中國凱基生物有限公司；Cell LightTMEdU 成像檢測試劑盒購自美國Ribbio 公司；DAPI 和RIPA 裂解緩沖液購自上海碧云天公司；奧林巴斯熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯；ChemiDoc XRS 凝膠/發(fā)光圖像分析儀購自美國Bio-Rad 公司；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀購自北京六一公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 標準培養(yǎng)條件下，采用含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 鏈霉素的F12 Kaighn 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549 細胞，并激活2～3 代。NCI-H661 細胞在RPMI1640中以相同條件培養(yǎng)，37 ℃、5%CO2和95%相對濕度空氣中孵育，隨后采用以上細胞進行細胞活力、增殖、侵襲、微管形成、炎癥水平和通路測定。添加AKT的特異性激活劑（SC79：4 μg/ml）進行驗證實驗［8］。添加抑制劑后的分組情況為：對照組、SC79 組、SC79+NC 12 nmol/L 組，分別測定通路磷酸化、細胞凋亡、侵襲和炎癥水平。

1.2.2 肺癌動物模型建立 48 只雄性BALB/c 小鼠（12 周齡）飼養(yǎng)于受控環(huán)境：光照12 h/黑暗12 h，（24±2）℃，55%～60%相對濕度。所有小鼠均可自由獲得水和食物。將48只BALB/c小鼠分為2組：模型對照組和NC 治療組（1.5 μg），建模前2 d 分別飼喂標準飼料和添加NC 的飼料，分別皮下注射A549細胞，造模后以2 d/次的給藥頻率繼續(xù)培養(yǎng)30 d。根據(jù)先前的報告和預實驗選擇動物模型中使用的NC 劑量［9］。5 d/次測量腫瘤體積。治療結束后，摘眼球法取血，收集血樣并以3 000 r/min離心1 min分離血漿用于指標測定。小鼠斷頸處死，解剖移植的腫瘤組織稱重，進行RT-PCR 和免疫組織化學檢測。所有動物實驗均經(jīng)南華大學附屬南華醫(yī)院倫理委員會批準，嚴格按照國際動物研究指導原則進行。

1.2.3 CCK-8 檢測 將細胞以1×105個/孔接種于96 孔板，每組設3 個復孔，體積100 μl，培養(yǎng)24 h，分別加入最終濃度為0、0.325、0.75、1.50、3、6、12、24、48、96、192 nmol/L 的NC 溶 液 處 理 細 胞，在5%CO2、37 ℃下于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h 后，10 μl/孔加入CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，培養(yǎng)過程中在一定時間于酶標儀上測定，達到最佳時間時即可終止培養(yǎng)，450 nm波長測定吸光值。

1.2.4 EdU 染色 各組細胞在24 孔培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。EdU 摻入試驗采用Cell LightTMEdU 成像檢測試劑盒，按照制造商說明書操作。

1.2.5 Transwell 實驗檢測侵襲 Transwell 小室加入50 μl 基質(zhì)膠并于37 ℃孵育3 h 凝固。將1.2.1分組及處理的細胞接種于Transwell 小室上室，其中上室為無血清培養(yǎng)基，下室為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取出小室，擦除未過膜的細胞后多聚甲醛固定，1%結晶紫染色后拍照。每組取3個隨機視野，計數(shù)視野中的染色細胞數(shù)目即為侵襲細胞數(shù)。

1.2.6 微管形成實驗 A549 和NCI-H661 細胞用各濃度NC 處理48 h。 將基質(zhì)膠與4 ℃預冷的無血清培養(yǎng)基以1∶1 比例混合。將混合物置于24 孔板底部，每孔300 μl，并在5%CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中固化30 min。在無血清RPMI1640 培養(yǎng)基中將濃度調(diào)整為1.2×105個/ml，將不同濃度NC 處理的A549和NCI-H661 細胞接種至上述24 孔板。每4 h 觀察1 次微管結構。100 倍顯微鏡下隨機取5 個視野，Microvision Saisam 軟件分析圖像，并計數(shù)每5 個視野的微管狀結構。

1.2.7 RT-PCR 檢測 用Trizol 提取各組細胞中RNA，并以逆轉(zhuǎn)錄法（RT法）先合成cDNA，然后進行PCR 擴增，循環(huán)條件95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個循環(huán)。引物序列為iNOS F：5'-ACTTTCCAAGCACACTTCAC-3'，R：5'-TTCGATAGCTTGAGGTAGAAGC-3'；TNF-α F：5'-CAATGGCGTGGAGCTGAGAG-3'，R：5'-TCTGGTAGGAGACGGCGATG-3'；IL-4 F：5'-CACAACTGAGAAGGAAACCTTCTG-3'，R：5'-CTCTCTCATGATCGTCTTTAGCCTTTC-3'；IL-10 F：5'-TGTCATCGATTTCTTCCCTGT-3'，R：5'-GGCTTTGTAGATGCCTTTCCTT-3'；GAPDH F：5'-AATGGACAACTGGTCGTGGAC-3'，R：5'-CCCTC?CAGGGGATCTGTTTG-3'。RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后計算機圖像分析儀掃描，凝膠圖像分析系統(tǒng)對產(chǎn)物電泳條帶進行灰度分析，測定iNOS、TNF-α、IL-4 和IL-10 mRNA表達。

1.2.8 ELISA 檢測細胞和外周血中炎癥因子水平 收集各處理組細胞和外周血，根據(jù)ELISA 試劑盒操作說明檢測各組外周血中iNOS、TNF-α、IL-4和IL-10含量。

1.2.9 Western blot 從細胞和腫瘤組織勻漿中分別提取總蛋白（20 μg），并用BCA 試劑盒檢測。根據(jù)目標蛋白分子量將每個樣品中的總蛋白上樣到6%～12%SDS-PAGE 凝膠電泳中，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂乳封閉膜，并與一抗在4 ℃下孵育過夜。第2天取膜采用含Tween20（TBST）的Tris緩沖鹽水洗滌3次，然后在室溫下與山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）二抗共同孵育1 h，TBST洗滌3次，加入蛋白抗體：AKT（ab38449，1∶500）、p-AKT（ab8805，1∶500）、ERK1/2（ab17942，1∶1 000）、p-ERK1/2（ab214362，1∶1 000）、VEGF（ab32152，1∶250）、N-cadherin（ab76011，1∶5 000）、E-cadherin（ab76055，1∶1 000）、內(nèi)參GAPDH（1∶1 000）。ECL 顯色曝光，采用Image J分析內(nèi)參GAPDH 和目標條帶灰度值，目標條帶蛋白水平=目標條帶灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)表示為±s。采用LSD法成對比較。t檢驗比較兩組符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NC對肺癌細胞生長的影響 采用CCK-8法檢測不同濃度NC 對肺癌細胞A549 和NCI-H661 活力的影響。如圖1B 所示，當NC 濃度>3 nmol/L 時，對A549細胞的活力具有抑制作用，當NC濃度>6 nmol/L時，對A549 和NCI-H661 細胞活力均有顯著抑制作用。根據(jù)CCK-8 實驗結果，選擇0、3、6、12 nmol/L 4 個劑量進行后續(xù)實驗。EdU 染色實驗結果表明當NC濃度>6 nmol/L時，對A549和NCI-H661細胞增殖能力均有顯著抑制作用（圖1C）。流式檢測結果表明NC 濃度>6 nmol/L 時，對A549 和NCI-H661 細胞凋亡均有顯著促進作用（圖1D）。以上結果表明NC可降低肺癌細胞活力和增殖能力，促進其凋亡。

圖1 NC對肺癌細胞生長的影響Fig.1 Effects of NC on growth of lung cancer cells

2.2 NC 對肺癌細胞侵襲和微管形成能力的影響采用Transwell 檢測細胞侵襲，微管形成實驗檢測血管新生，Western blot 檢測運動和成管相關蛋白VEGF、E-cad和N-cad表達。如圖2A、B所示，當NC>3 nmol/L 時，對A549 細胞侵襲數(shù)目和微管形成能力有抑制作用，當NC>6 nmol/L 時，對A549 和NCIH661 細胞侵襲數(shù)目和微管形成能力均有顯著抑制作 用。當NC>3 nmol/L 時，A549 細 胞 中VEGF 和N-cad 表達水平顯著降低，而E-cad 表達水平顯著提升，當NC>6 nmol/L 時，A549 和NCI-H661 細 胞 中VEGF 和N-cad 表達顯著降低，而E-cad 表達顯著提高（圖2C）。以上結果表明NC 對肺癌細胞運動和微管形成能力具有顯著抑制作用。

圖2 NC對肺癌細胞侵襲和微管形成能力的影響（×400）Fig.2 Effects of NC on lung cancer cell invasion and microtubule formation（×400）

2.3 NC對肺癌細胞抗炎能力的影響 采用RT-PCR和ELISA 檢測NC 對肺癌細胞抗炎能力的影響。ELISA 檢測結果如圖3A 所示，當NC>3 nmol/L 時，可顯著抑制A549 細胞中促炎因子iNOS 和TNF-α 表達，并提升抗炎因子IL-4 和IL-10 水平。如圖3B 所示，當NC>6 nmol/L時，可顯著抑制A549和NCI-H661細胞中促炎因子iNOS和TNF-α表達，并提升抗炎因子IL-4 和IL-10 水平。RT-PCR 檢測結果如圖3C、D所示，與ELISA檢測結果一致。以上結果表明NC可提升肺癌細胞抗炎能力。

圖3 NC對肺癌細胞抗炎能力的影響Fig.3 Effects of NC on anti-inflammatory ability of lung cancer cells

2.4 NC 通過抑制AKT/ERK1/2 通路磷酸化在體外發(fā)揮抗肺癌效果 為探究NC 發(fā)揮抗肺癌效果的機制，探究了NC 對AKT/ERK1/2 通路的影響。當NC>3 nmol/L 時，可顯著抑制A549 細胞中AKT/ERK1/2通路磷酸化水平，當NC>6 nmol/L時，可顯著抑制NCIH661細胞AKT/ERK1/2通路磷酸化水平（圖4A）。為進一步證實NC 通過AKT/ERK1/2 通路發(fā)揮抗肺癌效果，加入AKT 激活劑SC79。與對照組比較，SC79顯著促進A549細胞p-AKT/AKT和p-ERK1/2/ERK1/2水平，而NC 的添加顯著削弱了SC79 的作用（P<0.05）。與Western blot 實驗結果一致，SC79 顯著抑制A549 細胞凋亡，增加侵襲細胞數(shù)，提高促炎因子iNOS 水平并降低抗炎因子IL-4 水平，而NC 的添加顯著削弱了SC79 的作用（P<0.05，圖4D～F）。由此推測NC 通過抑制AKT/ERK1/2通路磷酸化發(fā)揮抗肺癌效果。

圖4 NC體外抑制AKT/ERK1/2通路磷酸化Fig.4 NC inhibits phosphorylation of AKT/ERK1/2 path?way in vitro

2.5 NC 通過抑制AKT/ERK1/2 通路磷酸化在體內(nèi)發(fā)揮抗肺癌效果 為探究NC 在肺癌大鼠體內(nèi)的抗癌效果，選擇BALB/c 小鼠為研究對象，通過皮下注射A549 建立體內(nèi)腫瘤模型，研究NC 在肺癌小鼠體內(nèi)的抗癌效果。如圖5A所示，與對照組比較，NC處理可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤形成（P<0.05）。與對照組比較，NC 顯著抑制了腫瘤體積和重量（P<0.05，圖5B、C）。免疫組化結果顯示，與對照組相比，NC可顯著提升caspase-3 水平并降低VEGF 水平（P<0.05，圖5D）。與對照組相比，NC 可顯著降低iNOS水平并提升IL-4水平（P<0.05，圖5E）。Western blot結果表明NC 可顯著抑制p-AKT/AKT 和p-ERK1/2/ERK1/2 水平，與體外實驗結果一致。因此推測NC在體內(nèi)通過抑制AKT/ERK1/2 通路磷酸化發(fā)揮抗肺癌效果。

圖5 NC體內(nèi)抑制AKT/ERK1/2通路磷酸化Fig.5 NC inhibits phosphorylation of AKT/ERK1/2 path?way in vivo

3 討論

肺癌的進展迅速，并且多個轉(zhuǎn)移發(fā)生在晚期。腫瘤轉(zhuǎn)移需要多種觸發(fā)癌細胞的分子機制，包括血管生成、血管重塑和免疫逃逸［10］。生物療法已廣泛應用于肺癌治療，但由于其靶點確定困難，經(jīng)濟負擔高等原因而沒有被廣泛接受。本次研究中NC 可顯著降低細胞活力、降低細胞EdU 陽性細胞數(shù)量、促進凋亡，抑制細胞侵襲，降低微管形成能力并提高細胞抗炎能力。與模型組相比，NC可抑制腫瘤生長。課題組還發(fā)現(xiàn)NC 對肺癌的抑制作用可能與其對AKT/ERK1/2 通路磷酸化的抑制有關。以上結果表明NC可能是一種潛在的肺癌治療劑。

眾所周知，一些中草藥成分對細胞有毒作用。為測試NC 對肺癌細胞系是否具有毒性作用，檢測了不同濃度NC 對A549 和NCI-H661 細胞活力的影響。數(shù)據(jù)表明，NC>6 nmol/L 時可顯著降低細胞活力。異常增殖是腫瘤細胞的典型特征，因此，抑制增殖成為腫瘤治療的有效方法之一。研究發(fā)現(xiàn)NC對惡性腫瘤細胞增殖具有明顯抑制作用［4］。一致地，本研究中EdU 染色結果顯示NC 可顯著降低肺癌細胞A549和NCI-H661中EdU陽性細胞數(shù)量。生物體內(nèi)各種類型組織細胞通過增殖和凋亡協(xié)調(diào)發(fā)展維持細胞數(shù)目平衡，但癌癥細胞存在明顯增殖和凋亡失調(diào)-過度增殖和細胞凋亡抑制現(xiàn)象［11］。腫瘤細胞的增殖情況和凋亡情況對癌癥治療至關重要。本研究中流式結果顯示，NC 可顯著提升A549 和NCI-H661細胞凋亡率，與EdU 染色測定的增殖結果一致。

微管結構的發(fā)達與否對腫瘤生長具有至關重要的影響。VEGF 是高度特異性的促血管內(nèi)皮生長因子，可促進增加的血管通透性，細胞外基質(zhì)變性，血管內(nèi)皮細胞遷移，增殖和血管生成。調(diào)節(jié)VEGF抑制血管生成并進一步阻斷癌癥的發(fā)展已成為一種新趨勢［12］。本研究中NC 可顯著抑制A549 和NCI-H661 細胞微管形成，一致地，Western blot 實驗結果顯示NC 可顯著抑制肺癌細胞中VEGF 表達。研究表明NC 對人鼻咽癌細胞生長和轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用［13］。本研究中Transwell 實驗結果顯示NC可顯著減少侵襲細胞數(shù)量，且Western blot實驗結果顯示NC 可提升E-cad 蛋白水平并降低N-cad 蛋白水平。可見NC對肺癌細胞遷移具有較好抑制作用。

iNOS 是誘導型一氧化氮合酶，已有證據(jù)表明iNOS 在病理生理炎癥、感染、腫瘤等疾病中起關鍵作用［14］。IL-10 和IL-4 是在炎癥發(fā)生和發(fā)展中起重要作用的抗炎遞質(zhì)。炎癥遞質(zhì)在各種細胞、組織和器官中起關鍵作用［15］。本研究中NC 治療顯著降低了大鼠外周血中iNOS 和TNF-α 水平并提升了IL-4和IL-10 水平。可見NC 處理可緩解肺癌細胞中的炎癥反應。

有學者發(fā)現(xiàn)NC 通過AKT/GSK-3β/Snail 信號通路抑制骨肉瘤細胞上皮向間充質(zhì)細胞遷移和侵襲［16］。ZHAI 等［17］研究發(fā)現(xiàn)NC 通過抑制ERK 信號通路抑制大腸癌細胞的增殖并誘導其凋亡。因此，預測NC 對肺癌體外和體內(nèi)的抑制作用是通過抑制AKT/ERK1/2 通路磷酸化實現(xiàn)的。本研究結果與預測一致，發(fā)現(xiàn)NC可顯著抑制p-AKT/AKT和p-ERK1/2/ERK1/2 磷酸化水平。通過添加AKT 激活劑（SC79）進行驗證實驗，與對照組相比，SC79 添加顯著提高了p-AKT/AKT 和p-ERK1/2/ERK1/2 表達水平，抑制了細胞凋亡，增加了侵襲細胞數(shù)目，提升了iNOS 水平并降低了IL-4 水平。而NC 的添加顯著削弱了SC79 的作用，并抑制了上述現(xiàn)象。可見NC 對肺癌的治療作用可能是通過其對AKT/ERK1/2 通路磷酸化的抑制作用實現(xiàn)的。

綜上所述，在體外NC 可抑制肺癌細胞生長、運動并提高其抗炎能力，在體內(nèi)NC 可抑制腫瘤形成，其潛在機制可能與NC 對AKT/ERK1/2 通路磷酸化的抑制有關。以上研究結果可為肺癌治療提供思路和依據(jù)。